Эксклюзионная хроматография , также известная как хроматография на молекулярных ситах , [1] представляет собой хроматографический метод, в котором молекулы в растворе разделяются по их форме , а в некоторых случаях и по размеру . [2] Обычно он применяется к большим молекулам или макромолекулярным комплексам, таким как белки и промышленные полимеры . [3] Обычно, когда для транспортировки образца через колонку используется водный раствор , метод известен как гель-фильтрационная хроматография , в отличие от названия гель-проникающая хроматография , которая используется, когда в качестве подвижной фазы используется органический растворитель. Хроматографическая колонка заполнена мелкими пористыми шариками, которые обычно состоят из полимеров декстрана , агарозы или полиакриламида . Размеры пор этих шариков используются для оценки размеров макромолекул . [1] SEC является широко используемым методом характеристики полимеров из-за его способности обеспечивать хорошие результаты распределения молярной массы (Mw) для полимеров.
Эксклюзионная хроматография (SEC) принципиально отличается от всех других хроматографических методов тем, что разделение основано на простой процедуре классификации размеров молекул, а не на каком-либо типе взаимодействия. [4]
Основное применение гель-хроматографии — фракционирование белков и других водорастворимых полимеров, в то время как гель-проникающая хроматография используется для анализа распределения молекулярной массы органорастворимых полимеров. Ни один из этих методов не следует путать с гель-электрофорезом , где электрическое поле используется для «протягивания» молекул через гель в зависимости от их электрических зарядов. Время, в течение которого растворенное вещество остается внутри поры, зависит от размера поры. Более крупные растворенные вещества будут иметь доступ к меньшему объему и наоборот. Поэтому меньшее растворенное вещество будет оставаться внутри поры в течение более длительного периода времени по сравнению с большим растворенным веществом. [5]
Несмотря на то, что эксклюзионная хроматография широко используется для изучения природных органических материалов, существуют ограничения. Одно из таких ограничений заключается в том, что не существует стандартного маркера молекулярной массы; [6] таким образом, не с чем сравнивать результаты. Если требуется точная молекулярная масса, следует использовать другие методы.
Преимущества этого метода включают хорошее разделение больших молекул от малых молекул с минимальным объемом элюата [7] и то, что различные растворы могут применяться без вмешательства в процесс фильтрации, при этом сохраняя биологическую активность разделяемых частиц. Метод обычно сочетается с другими, которые дополнительно разделяют молекулы по другим характеристикам, таким как кислотность, основность, заряд и сродство к определенным соединениям. При эксклюзионной хроматографии существуют короткие и четко определенные времена разделения и узкие полосы, что приводит к хорошей чувствительности. Также нет потери образца, поскольку растворенные вещества не взаимодействуют с неподвижной фазой.
Другим преимуществом этого экспериментального метода является то, что в некоторых случаях можно определить приблизительную молекулярную массу соединения. Форма и размер соединения (элюента) определяют, как соединение взаимодействует с гелем (стационарной фазой). Для определения приблизительной молекулярной массы получаются объемы элюирования соединений с их соответствующими молекулярными массами, а затем строится график «K av » против «log(Mw)», где и Mw — молекулярная масса. Этот график действует как калибровочная кривая, которая используется для приблизительного определения молекулярной массы желаемого соединения. Компонент V e представляет собой объем, при котором элюируются промежуточные молекулы, такие как молекулы, которые имеют частичный доступ к шарикам колонки. Кроме того, V t представляет собой сумму общего объема между шариками и объема внутри шариков. Компонент V o представляет собой объем, при котором элюируются более крупные молекулы, которые элюируются в начале. [8] [9] Недостатками являются, например, то, что можно разместить только ограниченное количество полос, поскольку временная шкала хроматограммы коротка, и, как правило, для хорошего разрешения должна быть разница в молекулярной массе в 10%. [7]
Метод был изобретен в 1955 году Грантом Генри Лате и Колином Р. Ратвеном, работавшими в больнице королевы Шарлотты в Лондоне. [10] [11] Позднее они получили премию Джона Скотта за это изобретение. [12] В то время как Лате и Ратвен использовали крахмальные гели в качестве матрицы, Джеркер Порат и Пер Флодин позже представили декстрановые гели; [13] другие гели со свойствами фракционирования по размеру включают агарозу и полиакриламид. Краткий обзор этих разработок появился. [14]
Были также попытки фракционировать синтетические высокополимеры; однако только в 1964 году, когда Дж. К. Мур из Dow Chemical Company опубликовал свою работу по изготовлению колонок для гель-проникающей хроматографии (ГПХ) на основе сшитого полистирола с контролируемым размером пор [15] , начался быстрый рост исследовательской активности в этой области. Почти сразу же было признано, что при правильной калибровке ГПХ способна предоставить информацию о молярной массе и распределении молярной массы для синтетических полимеров. Поскольку последнюю информацию было трудно получить другими методами, ГПХ быстро вошла в широкое использование. [16]
SEC используется в основном для анализа крупных молекул, таких как белки или полимеры. SEC работает путем улавливания более мелких молекул в порах адсорбента ( «стационарная фаза»). Этот процесс обычно выполняется в колонке, которая, как правило, состоит из полой трубки, плотно заполненной полимерными шариками микронного масштаба, содержащими поры разных размеров. Эти поры могут быть углублениями на поверхности или каналами через шарик. По мере того, как раствор перемещается вниз по колонке, некоторые частицы попадают в поры. Более крупные частицы не могут войти в столько же пор. Чем больше частицы, тем быстрее элюирование. Более крупные молекулы просто проходят мимо пор, потому что эти молекулы слишком велики, чтобы войти в поры. Следовательно, более крупные молекулы протекают через колонку быстрее, чем более мелкие молекулы, то есть, чем меньше молекула, тем больше время удерживания.
Одним из требований для SEC является то, что аналит не взаимодействует с поверхностью неподвижных фаз, при этом различия во времени элюирования между аналитами в идеале основываются исключительно на объеме растворенного вещества, в который могут войти аналиты, а не на химических или электростатических взаимодействиях с неподвижными фазами. Таким образом, небольшая молекула, которая может проникнуть в каждую область системы пор неподвижной фазы, может войти в общий объем, равный сумме всего объема пор и межчастичного объема. Эта небольшая молекула элюируется поздно (после того, как молекула проникнет во весь объем пор и межчастичного объема — примерно 80% объема колонки). С другой стороны, очень большая молекула, которая не может проникнуть ни в одну из более мелких пор, может войти только в межчастичный объем (~35% объема колонки) и элюируется раньше, когда этот объем подвижной фазы пройдет через колонку. Основной принцип SEC заключается в том, что частицы разных размеров элюируются (фильтруются) через неподвижную фазу с разной скоростью. Это приводит к разделению раствора частиц по размеру. При условии, что все частицы загружены одновременно или почти одновременно, частицы одинакового размера должны элюироваться вместе.
Однако, поскольку существуют различные меры размера макромолекулы (например, радиус инерции и гидродинамический радиус), фундаментальной проблемой в теории SEC был выбор надлежащего параметра размера молекулы, с помощью которого разделяются молекулы разных видов. Экспериментально Бенуа и его коллеги обнаружили прекрасную корреляцию между объемом элюирования и динамически обоснованным размером молекулы, гидродинамическим объемом , для нескольких различных цепей архитектуры и химических составов. [17] Наблюдаемая корреляция, основанная на гидродинамическом объеме, была принята в качестве основы универсальной калибровки SEC.
Тем не менее, использование гидродинамического объема, размера, основанного на динамических свойствах, при интерпретации данных SEC не полностью понято. [18] Это связано с тем, что SEC обычно проводится в условиях низкой скорости потока, где гидродинамический фактор должен оказывать незначительное влияние на разделение. Фактически, как теория, так и компьютерное моделирование предполагают термодинамический принцип разделения: процесс разделения определяется равновесным распределением (разделением) макромолекул растворенного вещества между двумя фазами: разбавленной фазой объемного раствора, расположенной в междоузлии, и ограниченными фазами раствора в порах материала насадки колонки. На основе этой теории было показано, что соответствующим параметром размера для разделения полимеров в порах является средний размер диапазона (средняя максимальная проекция на линию). [19] Хотя этот вопрос не был полностью решен, вероятно, что средний размер диапазона и гидродинамический объем сильно коррелируют.
Каждая колонка с исключением по размеру имеет диапазон молекулярных масс, которые могут быть разделены. Предел исключения определяет молекулярную массу на верхнем конце «рабочего» диапазона колонки и находится там, где молекулы слишком велики, чтобы попасть в стационарную фазу. Нижний предел диапазона определяется пределом проницаемости, который определяет молекулярную массу молекулы, которая достаточно мала, чтобы проникнуть во все поры стационарной фазы. Все молекулы ниже этой молекулярной массы настолько малы, что они элюируются как одна полоса. [7]
Отфильтрованный раствор, который собирается в конце, называется элюатом . Объем пустот включает любые частицы, слишком большие для проникновения в среду, а объем растворителя называется объемом колонки .
Ниже приведены материалы, которые обычно используются для пористых гелевых гранул в эксклюзионной хроматографии [20]
В реальных ситуациях частицы в растворе не имеют фиксированного размера, что приводит к вероятности того, что частица, которая в противном случае была бы затруднена порой, проходит прямо мимо нее. Кроме того, частицы неподвижной фазы не определены идеально; и частицы, и поры могут различаться по размеру. Поэтому кривые элюирования напоминают гауссовы распределения . Неподвижная фаза также может нежелательным образом взаимодействовать с частицей и влиять на время удерживания, хотя производители колонок прилагают большие усилия, чтобы использовать неподвижные фазы, которые инертны и минимизируют эту проблему.
Как и в других формах хроматографии, увеличение длины колонки повышает разрешение, а увеличение диаметра колонки увеличивает ее емкость. Правильная упаковка колонки важна для максимального разрешения: переупакованная колонка может разрушить поры в шариках, что приведет к потере разрешения. Недоупакованная колонка может уменьшить относительную площадь поверхности неподвижной фазы, доступную для более мелких видов, в результате чего эти виды будут проводить меньше времени в порах. В отличие от методов аффинной хроматографии, головка растворителя в верхней части колонки может резко снизить разрешение, поскольку образец диффундирует перед загрузкой, расширяя элюирование по потоку.
В простых ручных колонках элюент собирается в постоянных объемах, известных как фракции. Чем более схожи частицы по размеру, тем больше вероятность, что они находятся в одной фракции и не будут обнаружены по отдельности. Более продвинутые колонки решают эту проблему, постоянно контролируя элюент.
Собранные фракции часто исследуются спектроскопическими методами для определения концентрации элюированных частиц. Распространенными методами спектроскопического обнаружения являются показатель преломления (RI) и ультрафиолет (UV). При элюировании спектроскопически схожих видов (например, во время биологической очистки) могут потребоваться другие методы для определения содержимого каждой фракции. Также возможно непрерывно анализировать поток элюента с помощью RI, LALLS , многоуглового лазерного рассеяния света MALS, УФ и/или измерений вязкости.
Объем элюирования (Ve) уменьшается примерно линейно с логарифмом молекулярного гидродинамического объема . Колонки часто калибруются с использованием 4-5 стандартных образцов (например, свернутые белки с известной молекулярной массой) и образца, содержащего очень большую молекулу, такую как тиреоглобулин, для определения объема пустот. (Синий декстран не рекомендуется для определения Vo, поскольку он гетерогенен и может давать непостоянные результаты). Объемы элюирования стандартов делятся на объем элюирования тиреоглобулина (Ve/Vo) и наносятся на график в зависимости от логарифма молекулярных масс стандартов.
В целом, SEC считается хроматографией низкого разрешения, поскольку она не очень хорошо различает похожие виды, и поэтому часто резервируется для конечного этапа очистки. Метод позволяет определить четвертичную структуру очищенных белков, которые имеют медленное время обмена, поскольку его можно проводить в условиях нативного раствора, сохраняя макромолекулярные взаимодействия. SEC также может анализировать третичную структуру белка , поскольку он измеряет гидродинамический объем (не молекулярный вес), что позволяет различать свернутые и развернутые версии одного и того же белка. Например, кажущийся гидродинамический радиус типичного домена белка может составлять 14 Å и 36 Å для свернутой и развернутой форм соответственно. SEC позволяет разделить эти две формы, поскольку свернутая форма элюируется гораздо позже из-за ее меньшего размера.
SEC может использоваться в качестве меры как размера, так и полидисперсности синтезированного полимера , то есть способности находить распределение размеров полимерных молекул. Если стандарты известного размера были запущены ранее, то можно создать калибровочную кривую для определения размеров интересующих полимерных молекул в растворителе, выбранном для анализа (часто ТГФ ). Альтернативным способом такие методы, как рассеяние света и/или вискозиметрия, могут использоваться онлайн с SEC для получения абсолютных молекулярных масс, которые не зависят от калибровки со стандартами известной молекулярной массы. Из-за разницы в размерах двух полимеров с одинаковой молекулярной массой абсолютные методы определения, как правило, более желательны. Типичная система SEC может быстро (примерно за полчаса) предоставить химикам-полимерщикам информацию о размере и полидисперсности образца. Препаративная SEC может использоваться для фракционирования полимеров в аналитическом масштабе.
В SEC измеряется не столько масса, сколько гидродинамический объем полимерных молекул, то есть сколько места занимает конкретная полимерная молекула, когда она находится в растворе. Однако приблизительную молекулярную массу можно рассчитать из данных SEC, поскольку можно найти точное соотношение между молекулярной массой и гидродинамическим объемом для полистирола. Для этого в качестве стандарта используется полистирол. Но соотношение между гидродинамическим объемом и молекулярной массой не одинаково для всех полимеров, поэтому можно получить только приблизительное измерение. [21] Другим недостатком является возможность взаимодействия между неподвижной фазой и аналитом. Любое взаимодействие приводит к более позднему времени элюирования и, таким образом, имитирует меньший размер аналита.
При выполнении этого метода полосы элюирующих молекул могут расширяться. Это может происходить из-за турбулентности, вызванной потоком молекул подвижной фазы, проходящим через молекулы неподвижной фазы. Кроме того, молекулярная термодиффузия и трение между молекулами стеклянных стенок и молекулами элюента способствуют расширению полос. Помимо расширения, полосы также перекрываются друг с другом. В результате элюент обычно значительно разбавляется. Можно предпринять несколько мер предосторожности, чтобы предотвратить вероятность расширения полос. Например, можно нанести образец в узкую, высококонцентрированную полосу на верхнюю часть колонки. Чем более концентрирован элюент, тем эффективнее будет процедура. Однако не всегда возможно сконцентрировать элюент, что можно считать еще одним недостатком. [9]
Абсолютная эксклюзионная хроматография (ASEC) — это метод, который объединяет прибор для рассеяния света, чаще всего многоугловое рассеяние света (MALS) или другую форму статического рассеяния света (SLS), но, возможно, и прибор для динамического рассеяния света (DLS), с системой эксклюзионной хроматографии для измерения абсолютной молярной массы и/или размера белков и макромолекул по мере их элюирования из хроматографической системы. [22]
Определение «абсолютного» в данном случае заключается в том, что калибровка времени удерживания на колонке с набором эталонных стандартов не требуется для получения молярной массы или гидродинамического размера, часто называемого гидродинамическим диаметром (D H в единицах нм). Неидеальные взаимодействия колонок, такие как электростатические или гидрофобные поверхностные взаимодействия, которые модулируют время удерживания относительно стандартов, не влияют на конечный результат. Аналогично, различия между конформацией аналита и стандарта не влияют на абсолютное измерение; например, при анализе MALS молярная масса изначально неупорядоченных белков характеризуется точно, даже если они элюируются гораздо раньше, чем глобулярные белки с той же молярной массой, и то же самое верно для разветвленных полимеров, которые элюируются поздно по сравнению с линейными эталонными стандартами с той же молярной массой. [22] [23] [24] Другим преимуществом ASEC является то, что молярная масса и/или размер определяются в каждой точке пика элюирования и, следовательно, указывают на однородность или полидисперсность внутри пика. Например, анализ монодисперсного белка методом SEC-MALS покажет, что весь пик состоит из молекул с одинаковой молярной массой, что невозможно при стандартном анализе SEC.
Определение молярной массы с помощью SLS требует объединения измерений рассеяния света с измерениями концентрации. Поэтому SEC-MALS обычно включает детектор рассеяния света и либо дифференциальный рефрактометр , либо детектор поглощения УФ/видимого диапазона. Кроме того, MALS определяет среднеквадратичный радиус R g молекул выше определенного предела размера, обычно 10 нм. Поэтому SEC-MALS может анализировать конформацию полимеров через отношение молярной массы к R g . Для более мелких молекул добавляют либо DLS, либо, что более распространено, дифференциальный вискозиметр для определения гидродинамического радиуса и оценки молекулярной конформации таким же образом.
В SEC-DLS размеры макромолекул измеряются по мере их элюирования в проточную ячейку прибора DLS из набора колонок для исключения размера. Измеряется гидродинамический размер молекул или частиц, а не их молекулярный вес. Для белков можно использовать расчет типа Марка-Хаувинка для оценки молекулярного веса по гидродинамическому размеру.
Главным преимуществом DLS в сочетании с SEC является возможность получения улучшенного разрешения DLS. [25] Пакетный DLS быстрый и простой и обеспечивает прямое измерение среднего размера, но базовое разрешение DLS составляет соотношение 3:1 по диаметру. Используя SEC, белки и олигомеры белков разделяются, что позволяет проводить олигомерное разделение. Исследования агрегации также можно проводить с помощью ASEC. Хотя концентрация агрегата не может быть рассчитана с помощью рассеяния света (онлайн-детектор концентрации, такой как тот, который используется в SEC-MALS для измерения молярной массы, также определяет концентрацию агрегата), размер агрегата может быть измерен, ограниченный только максимальным размером, элюируемым из колонок SEC.
Ограничения ASEC с обнаружением DLS включают скорость потока, концентрацию и точность. Поскольку для правильного построения корреляционной функции требуется от 3 до 7 секунд, ограниченное количество точек данных может быть собрано по всему пику. ASEC с обнаружением SLS не ограничено скоростью потока, а время измерения по существу мгновенно, а диапазон концентрации на несколько порядков больше, чем для DLS. Однако анализ молярной массы с помощью SEC-MALS требует точных измерений концентрации. Детекторы MALS и DLS часто объединяются в одном приборе для более полного абсолютного анализа после разделения с помощью SEC.
