Сайленсинг генов — это регуляция экспрессии генов в клетке с целью предотвращения экспрессии определенного гена . [1] [2] Замалчивание генов может происходить как во время транскрипции , так и во время трансляции , и его часто используют в исследованиях. [1] [2] В частности, методы, используемые для подавления генов, все чаще используются для создания терапевтических средств для борьбы с раком и другими заболеваниями, такими как инфекционные заболевания и нейродегенеративные расстройства .
Замалчивание генов часто считают тем же, что и нокдаун генов . [3] [4] Когда гены молчат, их экспрессия снижается. [3] [4] Напротив, когда гены нокаутированы, они полностью стираются из генома организма и, таким образом, не имеют экспрессии. [3] [4] Замалчивание генов считается механизмом нокдауна генов, поскольку методы, используемые для подавления генов, такие как RNAi , CRISPR или siRNA , обычно снижают экспрессию гена как минимум на 70%, но не устраняют ее [ цитата по ссылке] нужный ] . Методы, использующие подавление генов, часто считаются лучшими, чем нокаут генов , поскольку они позволяют исследователям изучать важные гены, которые необходимы для выживания животных моделей и не могут быть удалены. Кроме того, они дают более полное представление о развитии заболеваний, поскольку заболевания обычно связаны с генами, экспрессия которых снижена. [3]
Антисмысловые олигонуклеотиды были открыты в 1978 году Полом Замечником и Мэри Стивенсон. [5] Олигонуклеотиды , которые представляют собой короткие фрагменты нуклеиновой кислоты , связываются с комплементарными молекулами мРНК-мишени при добавлении в клетку. [5] [6] Эти молекулы могут состоять из одноцепочечной ДНК или РНК и обычно имеют длину 13–25 нуклеотидов. [6] [7] Антисмысловые олигонуклеотиды могут влиять на экспрессию генов двумя способами: с помощью РНКазы H -зависимого механизма или с помощью механизма стерического блокирования. [6] [7] РНКаза H-зависимые олигонуклеотиды вызывают деградацию молекул -мишеней мРНК , в то время как стерические блокирующие олигонуклеотиды предотвращают трансляцию молекулы мРНК. [6] [7] Большинство антисмысловых препаратов действуют посредством РНКазы H-зависимого механизма, при котором РНКаза H гидролизует цепь РНК гетеродуплекса ДНК/РНК . [6] [7] выражение. [6]
Рибозимы представляют собой каталитические молекулы РНК, используемые для ингибирования экспрессии генов . Эти молекулы работают, расщепляя молекулы мРНК , по существу подавляя гены, которые их производят. Сидни Альтман и Томас Чех впервые открыли каталитические молекулы РНК, РНКазу P и интронные рибозимы группы II, в 1989 году и получили за свое открытие Нобелевскую премию. [8] [9] Существует несколько типов рибозимных мотивов, включая «головку молотка », «шпильку» , вирус гепатита дельта , группу I , группу II и рибозимы РНКазы . Рибозимные мотивы «молот-молот», «шпилька» и рибозимы вируса гепатита дельта (HDV) обычно встречаются в вирусах или вироидных РНК. [8] Эти мотивы способны самостоятельно расщеплять специфическую фосфодиэфирную связь на молекуле мРНК. [8] Низшие эукариоты и некоторые бактерии содержат рибозимы группы I и группы II. [8] Эти мотивы могут самосращиваться путем расщепления и соединения фосфодиэфирных связей. [8] Последний мотив рибозима, рибозим РНКазы P, обнаружен в Escherichia coli и известен своей способностью расщеплять фосфодиэфирные связи нескольких предшественников тРНК при присоединении к белку-кофактору. [8]
Общий каталитический механизм , используемый рибозимами, подобен механизму, используемому протеинрибонуклеазами . [10] Эти каталитические молекулы РНК связываются с определенным участком и атакуют соседний фосфат в основной цепи РНК своим 2'-кислородом, который действует как нуклеофил , что приводит к образованию продуктов расщепления с 2'3'-циклическим фосфатом и 5'-гидроксильный конец. [10] Этот каталитический механизм все чаще используется учеными для специфического расщепления молекул-мишеней мРНК. Кроме того, предпринимаются попытки использовать рибозимы для создания терапевтических средств, подавляющих гены, которые заставят замолчать гены, ответственные за возникновение заболеваний. [11]
РНК-интерференция ( РНКи ) — это естественный процесс, используемый клетками для регулирования экспрессии генов. Он был открыт в 1998 году Эндрю Файром и Крейгом Мелло , получившими Нобелевскую премию за свое открытие в 2006 году . [12] Процесс подавления генов сначала начинается с проникновения в клетку молекулы двухцепочечной РНК (дцРНК) . который запускает путь RNAi. [12] Двухцепочечная молекула затем разрезается на небольшие двухцепочечные фрагменты ферментом Dicer . [12] Эти небольшие фрагменты, которые включают малые интерферирующие РНК (миРНК) и микроРНК (миРНК) , имеют длину примерно 21–23 нуклеотида. [12] [13] Фрагменты интегрируются в многосубъединичный белок, называемый РНК-индуцированным комплексом молчания , который содержит белки Argonaute , которые являются важными компонентами пути RNAi. [12] [13] Одна цепь молекулы, называемая «направляющей» цепью, связывается с RISC, в то время как другая цепь, известная как «пассажирская» цепь, разрушается. [12] [13] Направляющая или антисмысловая цепь фрагмента, который остается связанным с RISC, управляет специфичным для последовательности молчанием целевой молекулы мРНК. [13] Гены могут быть подавлены молекулами миРНК, которые вызывают эндонуклеатическое расщепление молекул-мишеней мРНК, или молекулами миРНК, которые подавляют трансляцию молекулы мРНК. [13] При расщеплении или репрессии трансляции молекул мРНК гены, которые их образуют, становятся практически неактивными. [12] Считается, что РНКи развилась как механизм клеточной защиты от захватчиков, таких как РНК-вирусы , или для борьбы с пролиферацией транспозонов в ДНК клетки. [12] И РНК-вирусы, и транспозоны могут существовать в виде двухцепочечной РНК и приводить к активации РНКи. [12] В настоящее время миРНК широко используются для подавления специфической экспрессии генов и для оценки функции генов . Компании, использующие этот подход, включают Alnylam , Sanofi , [14] , Arrowhead, Discerna, [15] и Persomics , [16] и другие.
Три основных нетранслируемых региона (3'UTR) информационных РНК (мРНК) часто содержат регуляторные последовательности, которые посттранскрипционно вызывают молчание генов. Такие 3'-UTR часто содержат как сайты связывания микроРНК (миРНК), так и регуляторные белки . Связываясь со специфическими сайтами внутри 3'-UTR, большое количество специфических микроРНК снижают экспрессию генов их конкретных целевых мРНК, либо ингибируя трансляцию , либо напрямую вызывая деградацию транскрипта, используя механизм, аналогичный РНК-интерференции (см. МикроРНК ). 3'-UTR также может иметь участки сайленсера, которые связывают белки-репрессоры, ингибирующие экспрессию мРНК. [ нужна цитата ]
3'-UTR часто содержит элементы ответа микроРНК (MRE) . MRE — это последовательности, с которыми связываются микроРНК и вызывают молчание генов. Это преобладающие мотивы в 3'-UTR. Среди всех регуляторных мотивов в 3'-UTR (например, включая сайленсеры), MRE составляют около половины мотивов. [ нужна цитата ]
По состоянию на 2014 год на веб-сайте miRBase [17] , представляющем собой архив последовательностей и аннотаций микроРНК, было перечислено 28 645 записей о 233 биологических видах. Из них 1881 микроРНК находились в аннотированных локусах микроРНК человека. Было предсказано, что каждая микроРНК имеет в среднем около четырехсот целевых мРНК (вызывающих молчание нескольких сотен генов). [18] Фрейдман и др. [18] подсчитали, что >45 000 целевых сайтов микроРНК в 3'UTR мРНК человека консервативны выше фоновых уровней, и >60% генов , кодирующих белки человека , находились под селективным давлением для поддержания спаривания с микроРНК. [ нужна цитата ]
Прямые эксперименты показывают, что одна микроРНК может снизить стабильность сотен уникальных мРНК. [19] Другие эксперименты показывают, что одна микроРНК может подавлять выработку сотен белков, но эта репрессия часто бывает относительно мягкой (менее чем в 2 раза). [20] [21]
Эффекты нарушения регуляции экспрессии генов микроРНК, по-видимому, важны при раке. [22] Например, при раке желудочно-кишечного тракта девять микроРНК были идентифицированы как эпигенетически измененные и эффективные в подавлении ферментов репарации ДНК. [23]
Эффекты нарушения регуляции экспрессии генов микроРНК также кажутся важными при нервно-психических расстройствах, таких как шизофрения, биполярное расстройство, большая депрессия, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и расстройства аутистического спектра. [24] [25] [26]
Методы подавления генов широко используются исследователями для изучения генов, связанных с расстройствами. Эти расстройства включают рак , инфекционные заболевания , респираторные заболевания и нейродегенеративные расстройства . Сайленсинг генов в настоящее время также используется в усилиях по поиску лекарств, таких как синтетическая летальность , высокопроизводительный скрининг и миниатюрные скрининги РНКи. [ нужна цитата ]
РНК-интерференция использовалась для подавления генов, связанных с некоторыми видами рака. В исследованиях in vitro хронического миелогенного лейкоза (ХМЛ) миРНК использовалась для расщепления слитого белка BCR-ABL , который предотвращает связывание препарата Гливек ( иматиниб ) с раковыми клетками. [27] Расщепление слитого белка уменьшило количество трансформированных гемопоэтических клеток, которые распространяются по организму, за счет повышения чувствительности клеток к препарату. [27] РНК-интерференция также может быть использована для нацеливания на специфических мутантов. Например, миРНК были способны специфически связываться с молекулами-супрессорами опухолей р53 , содержащими одну точечную мутацию , и разрушать их, оставляя при этом супрессор дикого типа нетронутым. [28]
Рецепторы, участвующие в митогенных путях, которые приводят к увеличению производства раковых клеток, также подвергаются воздействию молекул миРНК. Хемокиновый рецептор хемокинового рецептора 4 (CXCR4) , связанный с пролиферацией рака молочной железы, был расщеплен молекулами siRNA, что уменьшило количество делений, обычно наблюдаемых в раковых клетках. [29] Исследователи также использовали миРНК для избирательного регулирования экспрессии генов, связанных с раком. Антиапоптотические белки, такие как кластерин и сурвивин , часто экспрессируются в раковых клетках. [30] [31] Кластерин и сурвивин-нацеленные миРНК использовались для уменьшения количества антиапоптотических белков и, таким образом, повышения чувствительности раковых клеток к химиотерапевтическому лечению. [30] [31] Исследования in vivo также все чаще используются для изучения потенциального использования молекул siRNA в терапии рака. Например, было обнаружено, что мыши, которым имплантировали клетки аденокарциномы толстой кишки, выживали дольше, если клетки предварительно обрабатывали миРНК, нацеленными на B-катенин в раковых клетках. [32]
Вирусные гены и гены-хозяева, которые необходимы вирусам для репликации или проникновения в клетку или которые играют важную роль в жизненном цикле вируса, часто подвергаются воздействию противовирусной терапии. РНКи использовалась для воздействия на гены при нескольких вирусных заболеваниях, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и гепатит . [33] [34] В частности, миРНК использовалась для подавления хемокинового рецептора 5 первичного рецептора ВИЧ (CCR5). [35] Это предотвратило попадание вируса в лимфоциты периферической крови человека и первичные гемопоэтические стволовые клетки. [35] [36] Аналогичный метод использовался для уменьшения количества обнаруживаемого вируса в клетках, инфицированных гепатитом B и C. При гепатите B подавление siRNA использовалось для воздействия на поверхностный антиген вируса гепатита B и приводило к уменьшению количества вирусных компонентов. [37] Кроме того, методы siRNA, используемые при гепатите С, смогли снизить количество вируса в клетке на 98%. [38] [39]
РНК-интерференция уже более 20 лет используется в коммерческих целях для борьбы с вирусными заболеваниями растений (см. Устойчивость растений к болезням ). В 1986–1990 годах было опубликовано множество примеров «опосредованной белками оболочки устойчивости» к вирусам растений, еще до того, как была открыта РНКи. [40] В 1993 году работа с вирусом травления табака впервые продемонстрировала, что организмы-хозяева могут нацеливаться на определенные последовательности вируса или мРНК для деградации, и что эта активность является механизмом, лежащим в основе некоторых примеров устойчивости к вирусу у трансгенных растений. [41] [42] Открытие малых интерферирующих РНК (определяющих специфичность РНК-опосредованного молчания генов) также использовало индуцированное вирусом посттранскрипционное молчание генов у растений. [43] К 1994 году были созданы трансгенные сорта тыквы, экспрессирующие гены белков оболочки трех разных вирусов, что позволило получить гибриды тыквы с проверенной на практике мультивирусной устойчивостью, которые продолжают использоваться в коммерческих целях в настоящее время. Линии картофеля, экспрессирующие последовательности вирусных репликаз, которые придают устойчивость к вирусу скручивания листьев картофеля, продавались под торговыми названиями NewLeaf Y и NewLeaf Plus и широко использовались в коммерческом производстве в 1999–2001 годах, пока корпорация McDonald's не решила не закупать ГМ- картофель, а компания Monsanto не решила. закрыть свой картофельный бизнес NatureMark. [44] Другой часто упоминаемый пример устойчивости к вирусам, опосредованный подавлением генов, касается папайи, где индустрию папайи на Гавайях спасла устойчивая к вирусам ГМ папайя, произведенная и лицензированная университетскими исследователями, а не крупной корпорацией. [45] Эти папайи также продолжают использоваться в настоящее время, хотя и не без значительного общественного протеста, [46] [47] что особенно менее очевидно в медицинских целях подавления генов.
Методы подавления генов также использовались для борьбы с другими вирусами, такими как вирус папилломы человека , вирус Западного Нила и вирус Тулейн. Ген E6 в образцах опухолей, полученных от пациентов с вирусом папилломы человека, был нацелен и обнаружил, что он вызывает апоптоз в инфицированных клетках. [48] Плазмидные векторы экспрессии siRNA, используемые для нацеливания на вирус Западного Нила, также были способны предотвращать репликацию вирусов в клеточных линиях. [49] Кроме того, было обнаружено, что миРНК успешно предотвращает репликацию вируса Тулейн, входящего в семейство вирусов Caliciviridae , путем воздействия как на его структурные, так и на неструктурные гены. [50] Было показано, что, воздействуя на ген NTPase, одна доза миРНК за 4 часа до заражения контролирует репликацию вируса Тулейн в течение 48 часов после заражения, снижая титр вируса до 2,6 логарифмов. [50] Хотя вирус Тулейн является видоспецифичным и не поражает людей, было показано, что он тесно связан с норовирусом человека , который является наиболее распространенной причиной острых гастроэнтеритов и вспышек заболеваний пищевого происхождения в Соединенных Штатах. [51] Норовирусы человека печально известны тем, что их трудно изучать в лаборатории, но вирус Тулейн предлагает модель, с помощью которой можно изучать это семейство вирусов с клинической целью разработки методов лечения, которые можно использовать для лечения заболеваний, вызванных норовирусом человека. [ нужна цитата ]
В отличие от вирусов, бактерии не так восприимчивы к подавлению миРНК. [52] Во многом это связано с тем, как размножаются бактерии. Бактерии размножаются вне клетки-хозяина и не содержат необходимых механизмов для функционирования РНКи. [52] Тем не менее, бактериальные инфекции все еще могут быть подавлены с помощью миРНК, воздействуя на гены хозяина, которые участвуют в иммунном ответе, вызванном инфекцией, или путем воздействия на гены хозяина, участвующие в опосредовании проникновения бактерий в клетки. [52] [53] Например, миРНК использовали для уменьшения количества провоспалительных цитокинов , экспрессируемых в клетках мышей, обработанных липополисахаридом (ЛПС) . [52] [54] Снижение экспрессии воспалительного цитокина, фактора некроза опухоли α (TNFα) , в свою очередь, вызывало уменьшение септического шока, ощущаемого мышами, получавшими ЛПС. [54] Кроме того, миРНК использовалась для предотвращения проникновения бактерий Psueomonas aeruginosa в эпителиальные клетки легких мышей путем нокдауна гена кавеолина-2 (CAV2). [55] Таким образом, хотя на бактерии нельзя напрямую воздействовать с помощью механизмов siRNA, на них все же может воздействовать siRNA, когда нацелены на компоненты, участвующие в бактериальной инфекции. [ нужна цитата ]
Рибозимы, антисмысловые олигонуклеотиды и с недавних пор РНКи стали использовать для воздействия на молекулы мРНК, участвующие в развитии астмы . [53] [56] Эти эксперименты показали, что миРНК можно использовать для борьбы с другими респираторными заболеваниями, такими как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и муковисцидоз . [53] ХОБЛ характеризуется гиперплазией бокаловидных клеток и гиперсекрецией слизи . [57] Было обнаружено, что секреция слизи снижается, когда трансформирующий фактор роста (TGF)-α воздействует на миРНК в эпителиальных клетках дыхательных путей человека NCI-H292 . [58] Помимо гиперсекреции слизи, для ХОБЛ и астмы характерны хроническое воспаление и повреждение легочной ткани. Считается, что трансформирующий фактор роста TGF-β играет роль в этих проявлениях. [59] [60] В результате, когда интерферон (IFN)-γ использовался для подавления TGF-β, фиброз легких, вызванный повреждением и рубцеванием легочной ткани, уменьшился. [61] [62]
Болезнь Хантингтона (БГ) возникает в результате мутации гена хантингтина , которая вызывает избыток CAG-повторов. [63] Затем ген образует мутированный белок хантингтина с полиглутаминовыми повторами вблизи аминоконца . [64] Это заболевание неизлечимо и, как известно, вызывает двигательные, когнитивные и поведенческие нарушения. [65] Исследователи рассматривают подавление генов как потенциальное средство лечения БГ. [ нужна цитата ]
Сайленсинг генов можно использовать для лечения БГ путем воздействия на мутантный белок хантингтина. Мутантный белок хантингтин был нацелен на подавление генов, которое является аллель-специфичным, с использованием аллель-специфичных олигонуклеотидов . В этом методе антисмысловые олигонуклеотиды используются для нацеливания на однонуклеотидный полиморфизм (SNP) , который представляет собой однонуклеотидные изменения в последовательности ДНК, поскольку было обнаружено, что у пациентов с HD есть общие SNP, которые связаны с мутировавшим аллелем хантингтина. Было обнаружено, что примерно 85% пациентов с ГБ можно охватить, если нацелиться на три SNP. Кроме того, когда антисмысловые олигонуклеотиды использовались для нацеливания на HD-ассоциированный SNP у мышей, наблюдалось 50% снижение количества мутантного белка хантингтина. [63]
Неаллель-специфическое подавление генов с использованием молекул siRNA также использовалось для подавления мутантных белков хантингтина. Благодаря этому подходу вместо нацеливания SNP на мутированный белок воздействуют на все нормальные и мутированные белки хантингтина. При исследовании на мышах было обнаружено, что миРНК может снижать уровни нормального и мутантного хантингтина на 75%. На этом уровне они обнаружили, что у мышей улучшился двигательный контроль и увеличилась выживаемость по сравнению с контрольной группой. [63] Таким образом, методы подавления генов могут оказаться полезными при лечении БГ.
Боковой амиотрофический склероз (БАС) , также называемый болезнью Лу Герига, представляет собой заболевание двигательных нейронов , поражающее головной и спинной мозг . Заболевание вызывает дегенерацию двигательных нейронов , что в конечном итоге приводит к гибели нейронов и мышечной дегенерации. [66] Было обнаружено , что сотни мутаций в гене супероксиддисмутазы Cu/Zn (SOD1) вызывают БАС. [67] Замалчивание генов использовалось для подавления мутанта SOD1, характерного для БАС. [67] [68] В частности, молекулы миРНК были успешно использованы для нацеливания на мутантный ген SOD1 и снижения его экспрессии посредством аллель-специфического подавления гена. [67] [69]
Существует несколько проблем, связанных с терапией, подавляющей гены, включая доставку и специфичность для клеток-мишеней. Например, для лечения нейродегенеративных заболеваний в мозг необходимо доставить молекулы для перспективной терапии, подавляющей гены. Гематоэнцефалический барьер затрудняет доставку молекул в мозг через кровоток, предотвращая прохождение большинства молекул, которые вводятся или всасываются в кровь. [63] [64] Таким образом, исследователи обнаружили, что им необходимо напрямую вводить молекулы или имплантировать насосы, которые проталкивают их в мозг. [63]
Однако, попав в мозг, молекулы должны переместиться внутрь целевых клеток. Для эффективной доставки молекул миРНК в клетки можно использовать вирусные векторы . [63] [65] Тем не менее, этот метод доставки также может быть проблематичным, поскольку он может вызвать иммунный ответ против молекул. Было обнаружено, что помимо доставки проблемой подавления генов является специфичность. Как антисмысловые олигонуклеотиды, так и молекулы миРНК потенциально могут связываться с неправильной молекулой мРНК. [63] Таким образом, исследователи ищут более эффективные методы доставки и разработки конкретных терапевтических средств, подавляющих гены, которые по-прежнему безопасны и эффективны. [ нужна цитата ]
«Арктические яблоки» — это сорт яблок, зарегистрированных под торговой маркой [70] , которые содержат признак отсутствия потемнения, созданный с помощью подавления генов для снижения экспрессии полифенолоксидазы (PPO). Это первый одобренный пищевой продукт, в котором используется такая технология. [71]
{{cite journal}}
: CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на январь 2024 г. ( ссылка )