Патогеномика — это область, которая использует высокопроизводительную технологию скрининга и биоинформатику для изучения кодированной устойчивости микробов, а также факторов вирулентности (VF), которые позволяют микроорганизму заражать хозяина и, возможно, вызывать заболевание. [1] [2] [3] [4] Это включает в себя изучение геномов патогенов , которые не могут быть культивированы вне хозяина. [5] В прошлом исследователи и медицинские специалисты сталкивались с трудностями в изучении и понимании патогенных признаков инфекционных организмов. [6] Благодаря новым технологиям геномы патогенов можно идентифицировать и секвенировать в гораздо более короткие сроки и с меньшими затратами, [7] [8] тем самым улучшая возможности диагностики, лечения и даже прогнозирования и предотвращения патогенных инфекций и заболеваний. [9] Это также позволило исследователям лучше понять события эволюции генома — потерю генов, приобретение, дупликацию, перестройку — и то, как эти события влияют на устойчивость патогенов и способность вызывать заболевание. [8] Этот приток информации создал потребность в биоинформатических инструментах и базах данных для анализа и предоставления исследователям доступа к огромным объемам данных, [10] [11] и поднял этические вопросы о целесообразности реконструкции ранее вымерших и смертельных патогенов с целью лучшего понимания вирулентности. [12]
На ранних этапах изучения геномики ученые сталкивались с трудностями при секвенировании генетической информации. [13] Эта область начала бурно развиваться в 1977 году, когда доктор философии Фред Сэнгер вместе со своими коллегами секвенировал ДНК-геном бактериофага , используя метод, который сейчас известен как метод Сэнгера . [14] [15] [16] Метод Сэнгера для секвенирования ДНК экспоненциально продвинул молекулярную биологию и напрямую привел к возможности секвенировать геномы других организмов, включая полный геном человека. [14] [15]
Геном Haemophilus influenza был одним из первых геномов организмов, секвенированных в 1995 году Дж. Крейгом Вентером и Гамильтоном Смитом с использованием полногеномного дробового секвенирования. [17] [15] С тех пор были разработаны более новые и более эффективные высокопроизводительные методы секвенирования, такие как геномное секвенирование следующего поколения (NGS) и геномное секвенирование отдельных клеток. [15] В то время как метод Сэнгера позволяет секвенировать один фрагмент ДНК за раз, технология NGS позволяет секвенировать тысячи последовательностей за раз. [18] Благодаря возможности быстрого секвенирования ДНК появились новые идеи, такие как открытие того, что, поскольку прокариотические геномы более разнообразны, чем первоначально считалось, необходимо секвенировать несколько штаммов одного вида, а не только несколько. [19] E.coli была примером того, почему это важно, поскольку гены, кодирующие факторы вирулентности в двух штаммах одного вида, различаются как минимум на тридцать процентов. [19] Такие знания, наряду с более тщательным изучением геномных приобретений, потерь и изменений, дают исследователям ценную информацию о том, как патогены взаимодействуют в среде хозяина и как они способны заражать хозяев и вызывать заболевания. [19] [13]
С таким большим притоком новой информации возник более высокий спрос на биоинформатику, чтобы ученые могли должным образом анализировать новые данные. В ответ на это были разработаны программное обеспечение и другие инструменты для этой цели. [10] [20] Кроме того, по состоянию на 2008 год количество хранимых последовательностей удваивалось каждые 18 месяцев, что сделало насущной необходимость в более эффективных способах организации данных и помощи в исследованиях. [21] В ответ на это было создано множество общедоступных баз данных и других ресурсов, включая программу обнаружения патогенов NCBI, Центр интеграции ресурсов Pathosystems (PATRIC), [22] Pathogenwatch, [23] Базу данных факторов вирулентности (VFDB) патогенных бактерий, [24] [3] [21] Базу данных Victors о факторах вирулентности патогенов человека и животных. [25] До 2022 года наиболее секвенированными патогенами были Salmonella enterica и E. coli - Shigella. [10] Технологии секвенирования, биоинформатические инструменты, базы данных, статистика, связанная с геномами патогенов, и применение в судебной экспертизе, эпидемиологии, клинической практике и безопасности пищевых продуктов были тщательно рассмотрены. [10]
Патогены могут быть прокариотическими ( археи или бактерии ), одноклеточными эукариотами или вирусами . Геномы прокариот обычно легче секвенировать из-за меньшего размера генома по сравнению с эукариотами. Из-за этого существует предвзятость в сообщении о поведении патогенных бактерий . Независимо от этого предвзятости в сообщении, многие динамические геномные события схожи во всех типах патогенных организмов. Геномная эволюция происходит посредством приобретения генов, потери генов и перестройки генома, и эти «события» наблюдаются в геномах нескольких патогенов, причем некоторые бактериальные патогены испытывают все три. [13] Однако патогеномика не фокусируется исключительно на понимании взаимодействий патоген-хозяин . Понимание индивидуального или кооперативного поведения патогена дает знания о развитии или наследовании факторов вирулентности патогена. [13] Благодаря более глубокому пониманию малых субъединиц, вызывающих инфекцию, может оказаться возможным разработать новые терапевтические средства, которые будут эффективными и экономически выгодными. [26]
Динамичные геномы с высокой пластичностью необходимы для того, чтобы патогены, особенно бактерии, могли выживать в изменяющихся условиях. [19] С помощью методов высокопроизводительного секвенирования и технологий in silico можно обнаружить, сравнить и каталогизировать многие из этих динамических геномных событий. Геномное разнообразие важно при обнаружении и лечении патогена, поскольку эти события могут изменить функцию и структуру патогена. [27] [28] Необходимо анализировать более одной последовательности генома вида патогена, чтобы понять механизмы патогена. Сравнительная геномика — это методология, которая позволяет ученым сравнивать геномы различных видов и штаммов. [29] Существует несколько примеров успешных сравнительных геномных исследований, среди которых анализ Listeria [30] и Escherichia coli . [31] Некоторые исследования пытались рассмотреть разницу между патогенными и непатогенными микробами. Однако это исследование оказывается сложным, поскольку один вид бактерий может иметь много штаммов, и геномное содержимое каждого из этих штаммов различается. [31]
Различные штаммы микробов и геномное содержимое обусловлены различными факторами, включая три конкретных эволюционных события, которые влияют на устойчивость к патогенам и способность вызывать заболевания: а) приобретение генов, потеря генов и перестройка генома. [13]
Потеря генов происходит, когда гены удаляются. Причина, по которой это происходит, до сих пор полностью не понята, [32] хотя, скорее всего, она связана с адаптацией к новой среде или экологической нише. [33] [34] Некоторые исследователи полагают, что потеря генов может на самом деле повышать приспособленность и выживаемость среди патогенов. [32] В новой среде некоторые гены могут стать ненужными для выживания, и поэтому мутации в конечном итоге «разрешаются» для этих генов, пока они не станут неактивными « псевдогенами ». [33] Эти псевдогены наблюдаются у таких организмов, как Shigella flexneri , Salmonella enterica , [35] и Yersinia pestis . [33] Со временем псевдогены удаляются, и организмы становятся полностью зависимыми от своего хозяина как эндосимбионты или облигатные внутриклеточные патогены , как это наблюдается у Buchnera , Myobacterium leprae и Chlamydia trachomatis . [33] Эти удаленные гены также называются генами антивирулентности (AVG), поскольку считается, что они могли помешать организму стать патогенным. [33] Чтобы стать более вирулентным, заразить хозяина и остаться в живых, патоген должен был избавиться от этих AVG. [33] Обратный процесс также может происходить, как было замечено во время анализа штаммов Listeria , который показал, что уменьшенный размер генома привел к образованию непатогенного штамма Listeria из патогенного штамма. [30] Были разработаны системы для обнаружения этих псевдогенов/AVG в последовательности генома. [8]
Одной из ключевых сил, движущих генный прирост, считается горизонтальный (латеральный) перенос генов (LGT). [36] Он представляет особый интерес в микробных исследованиях, поскольку эти мобильные генетические элементы могут вносить факторы вирулентности в новый геном. [37] Сравнительное исследование, проведенное Гиллом и др. в 2005 году, постулировало, что LGT мог быть причиной патогенных вариаций между Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus aureus . [38] Однако по-прежнему сохраняется скептицизм относительно частоты LGT, его идентификации и его воздействия. [39] Были задействованы новые и улучшенные методологии, особенно в изучении филогенетики , для подтверждения наличия и эффекта LGT. [40] События прироста генов и дупликации генов уравновешиваются потерей генов, так что, несмотря на их динамическую природу, геном бактериального вида остается примерно того же размера. [41]
Мобильные генетические последовательности вставок могут играть роль в деятельности по перестройке генома. [42] Было обнаружено, что патогены, которые не живут в изолированной среде, содержат большое количество элементов последовательности вставок и различных повторяющихся сегментов ДНК. [19] Считается, что сочетание этих двух генетических элементов помогает опосредовать гомологичную рекомбинацию . Существуют патогены, такие как Burkholderia mallei , [43] и Burkholderia pseudomallei [44] , которые, как было показано, демонстрируют перестройки по всему геному из-за последовательностей вставок и повторяющихся сегментов ДНК. [19] В настоящее время ни одно исследование не демонстрирует события перестройки по всему геному, напрямую приводящие к патогенному поведению микроба. Это не означает, что это невозможно. Однако перестройки по всему геному способствуют пластичности бактериального генома, что может подготовить условия для других факторов для введения или потери факторов вирулентности. [19]
Однонуклеотидные полиморфизмы , или SNP, допускают широкий спектр генетических вариаций среди людей, а также патогенов. Они позволяют исследователям оценивать различные факторы: воздействие токсинов окружающей среды, как различные методы лечения влияют на организм и что вызывает предрасположенность человека к болезням. [45] SNP играют ключевую роль в понимании того, как и почему происходят мутации. SNP также позволяют ученым картировать геномы и анализировать генетическую информацию. [45]
Обзор пангенома Самое последнее определение бактериального вида относится к догеномной эре. В 1987 году было предложено, что бактериальные штаммы, демонстрирующие >70% реассоциации ДНК·ДНК и разделяющие характерные фенотипические признаки, следует считать штаммами одного и того же вида. [46] Разнообразие внутри геномов патогенов затрудняет определение общего числа генов, которые связаны со всеми штаммами вида патогена. [46] Считалось, что общее число генов, связанных с одним видом патогена, может быть неограниченным, [46] хотя некоторые группы пытаются получить более эмпирическое значение. [47] По этой причине было необходимо ввести концепцию пангеномов и основных геномов. [48] Литература по пангеному и основному геному также имеет тенденцию иметь предвзятость в отношении сообщений о прокариотических патогенных организмах. Может потребоваться проявлять осторожность при расширении определения пангенома или основного генома на другие патогенные организмы, поскольку нет никаких формальных доказательств свойств этих пангеномов. [ необходима ссылка ]
Основной геном — это набор генов, обнаруженных во всех штаммах вида патогена. [46] Пангеном — это весь генофонд для этого вида патогена, и включает гены, которые не являются общими для всех штаммов. [46] Пангеномы могут быть открытыми или закрытыми в зависимости от того, выявляет ли сравнительный анализ нескольких штаммов отсутствие новых генов (закрытый) или много новых генов (открытый) по сравнению с основным геномом для этого вида патогена. [13] В открытом пангеноме гены могут быть далее охарактеризованы как необязательные или штаммоспецифичные. Необязательные гены — это те, которые обнаружены более чем в одном штамме, но не во всех штаммах вида патогена. [48] Штаммоспецифичные гены — это те, которые обнаружены только в одном штамме вида патогена. [48] Различия в пангеномах являются отражением образа жизни организма. Например, Streptococcus agalactiae , который существует в различных биологических нишах, имеет более широкий пангеном по сравнению с более изолированной от окружающей среды Bacillus anthracis . [19] Сравнительные геномные подходы также используются для того, чтобы лучше понять пангеном. [49] Недавние открытия показывают, что число новых видов продолжает расти, и на планете насчитывается около 10 31 бактериофагов, которые заражают 10 24 других в секунду, непрерывный поток обмена генетическим материалом трудно себе представить. [46]
Множественные генетические элементы патогенов, поражающих человека, способствуют передаче факторов вирулентности: плазмиды , остров патогенности , профаги , бактериофаги, транспозоны, а также интегративные и конъюгативные элементы. [13] [50] Острова патогенности и их обнаружение находятся в центре внимания нескольких биоинформатических усилий, связанных с патогеномикой. [51] [52] Распространено мнение, что «штаммы бактерий окружающей среды» не способны причинять вред или наносить ущерб людям. Однако недавние исследования показывают, что бактерии из водной среды приобрели патогенные штаммы в ходе эволюции. Это позволяет бактериям иметь более широкий спектр генетических признаков и может представлять потенциальную угрозу для людей, поскольку они более устойчивы к антибиотикам. [50]
Взаимодействие микроба с хозяином, как правило, затмевает рассмотрение взаимодействия микроба с микробом. Однако взаимодействие микроба с микробом может привести к хроническим состояниям немощи, которые трудно понять и лечить. [9]
Биопленки являются примером взаимодействия микробов и микробов и, как полагают, связаны с 80% человеческих инфекций. [53] Недавно было показано, что существуют определенные гены и белки клеточной поверхности, участвующие в формировании биопленки. [54] Эти гены, а также поверхностные белки могут быть охарактеризованы с помощью методов in silico для формирования профиля экспрессии бактерий, взаимодействующих с биопленкой. [9] Этот профиль экспрессии может быть использован в последующем анализе других микробов для прогнозирования поведения микробов биопленки или для понимания того, как разрушить образование биопленки. [9]
Патогены обладают способностью адаптироваться и манипулировать клетками хозяина, в полной мере используя клеточные процессы и механизмы клетки хозяина. [9]
Микроб может быть подвержен влиянию хозяев, чтобы либо адаптироваться к новой среде, либо научиться избегать ее. Понимание этих поведенческих особенностей даст полезные знания для потенциальных терапевтических средств. Наиболее подробный план инициатив по взаимодействию хозяина и микроба изложен в Европейской программе исследований патогенеза. [9] В ее отчете подчеркиваются следующие особенности:
Разнообразное сообщество в кишечнике было объявлено жизненно важным для здоровья человека. Существует ряд проектов, направленных на лучшее понимание экосистем кишечника. [58] Последовательность комменсального штамма Escherichia coli SE11, например, уже была определена из фекалий здорового человека и обещает стать первым из многих исследований. [59] Благодаря геномному анализу, а также последующему анализу белков, будет изучено лучшее понимание полезных свойств комменсальной флоры в надежде понять, как создать лучшее терапевтическое средство. [60]
«Эко-эво»-перспектива взаимодействия патогена и хозяина подчеркивает влияние экологии и окружающей среды на эволюцию патогена. [13] Динамические геномные факторы, такие как потеря генов, приобретение генов и перестройка генома, находятся под сильным влиянием изменений в экологической нише, где находится конкретный штамм микроба. Микробы могут переходить от патогенных к непатогенным из-за изменения окружающей среды. [30] Это было продемонстрировано во время исследований чумы, Yersinia pestis , которая, по-видимому, эволюционировала от слабого желудочно-кишечного патогена до очень высокопатогенного микроба посредством динамических геномных событий. [61] Для того чтобы произошла колонизация, должны произойти изменения в биохимическом составе, чтобы помочь выживанию в различных средах. Это, скорее всего, связано с механизмом, позволяющим клетке ощущать изменения в окружающей среде, тем самым влияя на изменение экспрессии генов. [62] Понимание того, как эти изменения штамма происходят от низко- или непатогенного до высокопатогенного и наоборот, может помочь в разработке новых терапевтических средств для лечения микробных инфекций. [13]
Здоровье людей значительно улучшилось, а уровень смертности существенно снизился после Второй мировой войны из-за улучшения гигиены в связи с изменением правил общественного здравоохранения, а также более доступными вакцинами и антибиотиками. [63] Патогеномика позволит ученым расширить свои знания о патогенных и непатогенных микробах, что позволит создавать новые и улучшенные вакцины. [63] Патогеномика также имеет более широкое применение, включая предотвращение биотерроризма. [63]
Обратная вакцинология относительно нова. Хотя исследования все еще ведутся, были достигнуты прорывы с такими патогенами, как стрептококк и менингит . [64] Методы производства вакцин, такие как биохимические и серологические, трудоемки и ненадежны. Они требуют, чтобы патогены были in vitro , чтобы быть эффективными. [65] Новые достижения в геномной разработке помогают предсказывать почти все вариации патогенов, тем самым делая успехи в вакцинах. [65] Вакцины на основе белков разрабатываются для борьбы с резистентными патогенами, такими как стафилококк и хламидии . [64]
В 2005 году была завершена последовательность испанского гриппа 1918 года . В сочетании с филогенетическим анализом стало возможным предоставить подробный отчет об эволюции и поведении вируса, в частности, его адаптации к человеку. [66] После секвенирования испанского гриппа был также реконструирован патоген. При введении в мышей патоген оказался невероятно смертоносным. [67] [12] Атаки сибирской язвы 2001 года пролили свет на возможность биотерроризма как более реальной, чем воображаемая угроза. Биотерроризм ожидался во время войны в Ираке, когда солдатам делали прививки для атаки с использованием оспы . [68] Используя технологии и знания, полученные в результате реконструкции испанского гриппа, возможно, удастся предотвратить будущие смертоносные вспышки заболеваний. Однако существует сильная этическая обеспокоенность относительно того, необходимо ли воскрешение старых вирусов и приносит ли оно больше вреда, чем пользы. [12] [69] Лучшим способом противодействия таким угрозам является координация с организациями, которые предоставляют вакцины. Повышение осведомленности и участия значительно снизит эффективность потенциальной эпидемии. Дополнением к этой мере может стать мониторинг природных водоемов в качестве основы для предотвращения атаки или вспышки. В целом, коммуникация между лабораториями и крупными организациями, такими как Глобальная сеть оповещения о вспышках заболеваний и реагирования на них (GOARN), может привести к раннему обнаружению и предотвращению вспышек. [63]