Гетерологичная экспрессия относится к экспрессии гена или части гена в организме хозяина , который естественным образом не имеет рассматриваемого гена или фрагмента гена. Вставка гена в гетерологичного хозяина выполняется с помощью технологии рекомбинантной ДНК . Целью гетерологичной экспрессии часто является определение эффектов мутаций и дифференциальных взаимодействий на функцию белка . Она обеспечивает простой путь для эффективной экспрессии и экспериментов с комбинациями генов и мутантов, которые не встречаются в природе.
В зависимости от продолжительности рекомбинации в геноме хозяина доступны два типа гетерологичной экспрессии: долгосрочная (стабильная) и краткосрочная (транзиторная). Долгосрочная — это потенциально постоянная интеграция в ген, а краткосрочная — это временная модификация, которая длится от 1 до 3 дней. [1]
После вставки в хозяина ген может быть интегрирован в ДНК хозяина , вызывая постоянную экспрессию, или не интегрирован, вызывая временную экспрессию . Гетерологичная экспрессия может осуществляться во многих типах организмов-хозяев. Организмом-хозяином может быть бактерия, дрожжи, клетка млекопитающего или клетка растения. Этот хозяин называется « системой экспрессии ». Гомологичная экспрессия, с другой стороны, относится к сверхэкспрессии гена в системе, из которой он происходит.
Идентификация генов может быть выполнена с использованием компьютерных методов, известных как методы гетерологичного скрининга. [2] Цифровая библиотека последовательностей кДНК содержит данные из многих проектов по секвенированию и обеспечивает легкий доступ к информации о последовательностях известных генов.
Если геномная последовательность неизвестна или недоступна, ДНК подвергается процессу случайной фрагментации, клонирования и скрининга для определения ее фенотипа. [3] Хотя для получения определенного гена можно использовать различные методы, самый простой способ выявить компоненты неизвестной последовательности ДНК — сначала идентифицировать ее рестриктазы. Рестриктазы — это ферменты, отвечающие за расщепление ДНК на фрагменты в определенном месте внутри молекул, известном как сайты рестрикции . Эти ферменты могут находиться в бактериях или археях и, как известно, защищают ДНК от чужеродного вторжения вирусов. Рестриктазы различны, и каждый распознает только определенную последовательность пар оснований в ДНК, многие из которых, как правило, являются палиндромными . Путем определения местоположения каждого фермента можно идентифицировать и выделить последовательность, связанную с рестриктазой.
Если последовательность известна, то для выделения интересующего гена можно использовать метод, называемый полимеразной цепной реакцией (ПЦР) . Целью ПЦР является не только идентификация, но и амплификация определенного сегмента ДНК через фазы денатурации, отжига и удлинения. Денатурация помещает двухцепочечную матрицу ДНК в условия высокой температуры 95 °C, чтобы разрушить ее слабые водородные связи и обеспечить разделение цепей. Отжиг охлаждает реакцию, позволяя водородным связям преобразоваться и способствовать связыванию праймера с их комплементарными последовательностями на одноцепочечной матрице ДНК. Наконец, этап удлинения включает в себя распознавание ДНК-полимеразой праймированной одноцепочечной ДНК и, следовательно, выделение определенных последовательностей, необходимых для репликации. [3]
Доставка генной пушки /Биолистика была привлекательным методом доставки генов из-за ее невирусных свойств, и в дополнение к вирусной трансдукции является одним из наиболее распространенных методов. Это позволяет добиться менее неблагоприятных иммунных реакций и снизить вероятность вирусной инфекции по сравнению с методами передачи на основе вирусов. Вместо использования вирусного вектора, этот метод использует физические методы, в частности, использование гелия для доставки векторов трансформации. Доставка генной пушки традиционно использовалась для генерации трансгенных растений, поскольку она могла эффективно и действенно проникать через клеточные стенки. Совсем недавно этот метод оказался успешным в клетках животных, которые не могут переносить бомбардировку высокого уровня, где вместо этого золотые частицы ДНК доставляются при более низком давлении гелия. Этот метод успешно использовался как in vitro, так и in vivo. [4]
Электропорация — это метод, который использует высокое напряжение для создания пор в мембранах клеток млекопитающих. Пульсируя электричеством, локальные области клеточной мембраны временно дестабилизируются, и ДНК может затем проникнуть в клетку. При соответствующей напряженности поля повреждение клетки-хозяина минимально. [5] Этот метод может использоваться как для краткосрочных, так и для долгосрочных трансфектантов. [6] Он также эффективен практически для любого типа ткани и показал высокие уровни доставки генов с увеличением распределения клеток, экспрессирующих ДНК. [5]
Вирусная трансдукция — это метод, который использует вирусные векторы и используется для стабильного внедрения генов в целевые клетки. В этом методе вирусный вектор (вирион) заражает клетки-хозяева, напрямую транспортируя ДНК в ядро клетки. Два распространенных типа вирусов, используемых для трансдукции, — это аденовирусы, которые, как правило, являются транзиторными, и лентивирусы, которые интегрируют ДНК в геном. Лентивирусные векторы также стали привлекательным вирусным инструментом, поскольку они могут трансдуцировать в неделящихся клетках, что позволяет осуществлять стабильный перенос в широком диапазоне типов клеток-хозяев. [7]
При липофекции ген вводится с помощью липосом . Последовательность ДНК инкапсулируется в липосому с тем же составом, что и клеточная мембрана. Этот метод позволяет ей напрямую сливаться с мембраной или подвергаться эндоцитозу, который затем высвобождает ДНК в клетку. Липофекция часто используется, поскольку она работает со многими различными типами клеток, является высоковоспроизводимой и является быстрым методом как для стабильной, так и для временной экспрессии. [8]
Гены часто подвергаются гетерологичной экспрессии для изучения специфических белковых взаимодействий. E. coli , дрожжи ( S. cerevisiae , P. pastoris ), бессмертные клетки млекопитающих и ооциты амфибий (т. е. неоплодотворенные яйца) обычно используются для исследований, требующих гетерологичной экспрессии. [9] При выборе конкретной системы необходимо учитывать экономические и качественные аспекты. Прокариотическая экспрессия широко используется в технологии рекомбинантной ДНК для формирования легко манипулируемых белков с помощью известных генетических методов с использованием недорогой среды. [10] К некоторым ограничениям относятся внутриклеточное накопление гетерологичных белков, неправильное сворачивание пептида, отсутствие посттранскрипционных модификаций, потенциальная деградация продукта из-за следов примесей протеазы и выработка эндотоксина.
Прокариотические и эукариотические системы, чаще всего бактерии, дрожжи, насекомые и клетки млекопитающих, а иногда и амфибии, грибы и простейшие, используются для исследований, требующих гетерологичной экспрессии. Бактерии, особенно E. coli, дрожжи (S. cerevisiae, P. pastoris), насекомые и клетки амфибий (ооциты) использовались в качестве эффективных хозяев для экспрессии чужеродных белков. Как правило, с прокариотами легче работать и они лучше понятны, и часто являются предпочтительной системой-хозяином. Он широко используется в технологии рекомбинантной ДНК для формирования легко манипулируемых белков с помощью известных генетических методов с недорогой средой. Однако для мембранных белков исследователи заметили, что клетки млекопитающих более эффективны. Это связано с отсутствием посттранскрипционных модификаций в прокариотических системах. Ограничения включают внутриклеточное накопление гетерологичных белков, неправильное сворачивание пептида, потенциальную деградацию продукта из-за следов примесей протеазы и выработку эндотоксина.
Популярной используемой системой является Escherichia coli из-за ее быстрой скорости роста (~20–30 минут), способности к непрерывной ферментации и относительно низкой стоимости. [9] Кроме того, дрожжи обладают способностью экспрессировать большой относительный объем гетерологичного белка. В частности, до 30% белков, продуцируемых дрожжами, могут быть продуктом гетерологичного гена. Существуют также безопасные штаммы E. coli, которые были успешно созданы для масштабирования производства. В дополнение к привлекательным свойствам хозяина E. coli, этот хозяин невероятно популярен из-за того, что исследователи имеют большой объем знаний о его генетике, включая полную геномную последовательность. Однако возникают проблемы либо из-за последовательности интересующего гена, либо из-за ограничений E. coli как хозяина. Например, белки, экспрессируемые в больших количествах в E. coli, имеют тенденцию осаждаться и агрегироваться, что затем требует другого метода восстановления денатурации, ренатурации. Наконец, E. coli оптимально эффективен только в определенных условиях, зависящих от вставленного гена.
Bacillus subtilis (B. subtilis) — это грамположительный, непатогенный организм, который не продуцирует липополисахариды (ЛПС). Известно, что ЛПС, обнаруженный в грамотрицательных бактериях, вызывает множество дегенеративных расстройств у людей и животных и влияет на выработку белков в E. coli. Поэтому, хотя он считается потенциально безопасным, B. subtilis официально не классифицирован FDA как в целом безопасный (GRAS). B. subtilis имеет генетические характеристики, которые легко трансформируют его с помощью бактериофагов и плазмид . [11] Кроме того, он может облегчить больше этапов очистки посредством прямой секреции в культуральную среду и может быть легко масштабирован из-за его способности неспецифически секретировать эти белки. На сегодняшний день B. subtilis успешно используется для изучения различных биологических механизмов, включая метаболизм, регуляцию генов, дифференциацию, экспрессию белков и генерацию биоактивных продуктов. Это также наиболее хорошо изученная грамположительная бактерия в мире, при этом геномная информация широко доступна. Недостатки этой системы-хозяина включают в себя сниженную или неэкспрессию интересующего белка и производство деградирующих внеклеточных протеаз, которые нацелены на гетерологичные белки. Наконец, несмотря на привлекательные свойства B. subtilis, эти ограничения приводят к тому, что E.coli становится системой-хозяином по умолчанию вместо B. subtilis. Однако при большем количестве исследований и оптимизации B. subtilis имеет потенциал для производства мембранных белков в больших масштабах. [12]
Эукариотические клетки могут использоваться в качестве альтернативы прокариотической экспрессии белков, предназначенных для терапевтического использования. Дрожжи — это одноклеточный грибок, который использует высокие уровни экспрессии, быстрый рост и недорогое обслуживание, подобно прокариотическим системам. Поскольку дрожжи являются пищевым организмом, они также подходят для производства фармацевтических продуктов, в отличие от E. coli, которая может содержать токсины. Дрожжи также имеют относительно быструю скорость роста, со временем удвоения 90 минут на простых средах, и ими легко манипулировать. Подобно E. coli, дрожжи также имеют полную геномную последовательность. Наиболее часто используемые дрожжи — это S. cerevisiae, которые могут выполнять посттрансляционные модификации, такие как процессинг белков и сворачивание белков. S. cerevisiae , P. pastoris — это простые эукариотические организмы, которые быстро растут и обладают высокой степенью адаптации. [13] Эукариотические системы применяются у людей и успешно производят вакцины от гепатита B и хантавируса . Происходит прогрессивное увеличение использования клеток млекопитающих для рекомбинантной технологии и синтеза полной биологической активности. Эта система секретирует и гликозилирует белки, одновременно вводя правильную укладку белков и посттрансляционные модификации. Однако при использовании повышенных способностей к гликозилированию часто наблюдается гиперманнозилирование или добавление большого количества маннозы. Это препятствует правильной укладке белков. В целом, дрожжи являются компромиссом между бактериальными и млекопитающими клетками и остаются популярной системой-хозяином. Стоимость производства при использовании дрожжей в качестве системы экспрессии высока из-за медленного роста и дорогостоящих потребностей в питательных веществах.
Бакуловирусы — это вирусы, которые заражают насекомых и появились как система гетерологичной экспрессии в эукариотах — насекомых. Как эукариоты, они имеют несколько важных функций, отсутствующих в дрожжевых и бактериальных системах, включая модификацию белков, процессинг и эукариотическую транспортную систему. Поскольку их можно размножать в очень высоких концентрациях, это упрощает процесс получения больших количеств рекомбинантных белков. Более того, исследователи обнаружили, что экспрессированные белки обычно локализуются в соответствующих им компартментах и их легко собирать. Эти геномы также имеют тенденцию быть очень большими и могут включать более крупные фрагменты по сравнению с прокариотическими системами, а также неинфекционны для позвоночных и клеток млекопитающих. Однако эти бакуловирусные векторы имеют ограничения. Поскольку эти вирусы изначально заражают беспозвоночных, могут быть различия в процессинге белков позвоночных, вызывающие некоторые вредные модификации. [14]
Неоплодотворенный ооцит лягушки, или Xenopus laevis, также использовался в качестве системы экспрессии для гетерологичной экспрессии. [15] Первоначально он использовался для экспрессии ацетилхолинового рецептора в 1982 году, с тех пор он использовался по разным причинам. Эти ооциты производятся лягушками круглый год и, таким образом, относительно многочисленны, а трансляция происходит с высокой точностью. Из многих ограничений системы ооцитов одним из основных является то, что произведенные гетерологичные белки взаимодействуют с белками ооцита лягушки, что изменяет его поведение по сравнению с тем, каким оно было бы в клетке млекопитающего. Кроме того, если млекопитающие диплоидны, эти xenopus имеют четыре гомологичных копии каждой хромосомы, и, таким образом, полученные белки могут иметь другую функцию. Необходимы дополнительные исследования для изучения производства белков системами X. laevis.
Хотя клетки млекопитающих культивируются с большей сложностью, требуют больше времени, больше питательных веществ и значительно дороже, белок, требующий посттрансляционных модификаций, должен быть экспрессирован в клетках млекопитающих, чтобы защитить клиническую эффективность и точность продукта. Однако даже между клетками млекопитающих наблюдаются различия, например, различия в гликозилировании между клетками грызунов и человека. Даже в пределах одной клеточной линии стабилизация клеточной линии часто приводит к измененным паттернам гликозилирования. Единственный коммерчески жизнеспособный способ использования клеток млекопитающих в качестве систем-хозяев — это конечный продукт высокой ценности. Распространенные линии клеток млекопитающих, особенно в исследованиях, включают COS-7 от обезьяны Cercopithecus aethiops, CHO от хомяка Cricetulus griseus и линию человеческой почки HEK293. [3]
Распространенной протистической эукариотической системой экспрессии является слизистая плесень Dictyostelium discoideum, и она уникальна, поскольку имеет кольцевую плазмиду, упакованную подобно хроматину. [16] Как простой эукариотический гаплоидный организм, он может расти в высоких концентрациях без дорогостоящих условий культивирования клеток млекопитающих и выполнять посттрансляционные модификации. Сам белок экспрессируется в нескольких формах, включая прикрепленную к мембране, секретируемую или связанную с клеткой, и может гликозилировать белковый продукт.
Грибы являются естественными разрушителями многих экосистем. В результате они способны секретировать большое количество ферментов, больше, чем бактериальные системы. Однако использование грибов в качестве систем экспрессии столкнулось с несколькими препятствиями, особенно из-за отсутствия знаний о генетике грибов из-за присущей им сложности. Нитчатые грибы, в частности, были интересной системой-хозяином и включают Penicillium (откуда был получен пенициллин), Trichoderma reesei и Aspergillus Niger. Нитчатые грибы эффективны в производстве внеклеточных белков, минуя дополнительный этап разрушения клеток для извлечения белков. Некоторые из них также имеют недорогие условия роста и среды. Грибы также обладают возможностями гликолиза и модификации, которые полезны для эукариотических белков. Кроме того, они также успешно производили белки, связанные с вакцинами, и некоторые нитчатые грибы были признаны FDA GRAS. Однако основным недостатком использования этой системы-хозяина является то, что урожайность крайне низкая и экономически невыгодна. Более того, небольшое количество вырабатываемого белка часто разрушается грибковыми протеазами. Некоторые подходы к решению этой проблемы заключаются в использовании штаммов с дефицитом протеазы. Исследователи также пытаются использовать различные методы разрушения генов. С лучшим пониманием регуляции и экспрессии грибковых генов мы можем ожидать, что нитчатые грибы станут потенциально жизнеспособной системой-хозяином. [16]
Исследователи часто используют гетерологичные методы экспрессии для изучения взаимодействия белков. Например, бактерии были оптимизированы для гетерологичной экспрессии и биосинтеза нитрогеназы через NifEN. Это может быть экспрессировано и сконструировано в E.coli. [17] Через этого хозяина остается чрезвычайно сложной задачей гетерологичная экспрессия сложного гетеромультимерного металлопротеина, такого как NifEN, с полным набором субъединиц, металлокластеров и функциональностью. Вариант NifEN, сконструированный в этом бактериальном хозяине, может сохранять свою эффективность кофактора в аналогичных сайтах связывания кофакторов, что подтверждает гетерологичную экспрессию и поощряет будущее исследование этого металлофермента. Кроме того, недавно появились сообщения о полезности новых нитчатых грибковых систем в производстве промышленных белков. Преимущества включают высокую частоту трансформации, производство белков при нейтральном pH, низкую вязкость ферментационного бульона из-за выбора штамма для ненитчатого формата и короткое время ферментации. Многие продукты человеческих генов, такие как альбумин, IgG и интерлейкин 6, были выражены в гетерологичных системах с разной степенью успеха. [18] Непоследовательные результаты намекнули на переход от исследований генов к подходу к посттрансляционной модификации всего организма. Ооциты легко оптимизируются для их большого размера и трансляционной способности, что позволяет наблюдать интегрированные клеточные реакции. Это относится к исследованиям отдельных молекул в отдельных клетках для приложений скрининга лекарств со средней пропускной способностью. Скрининг ооцитов на экспрессию инъецированной кДНК позволяет дополнительно изучить применение микроинъекции в качестве модели гетерологичной экспрессии с точки зрения клеточной сигнализации, транспорта, архитектуры и функции белка. [15]
Гетерологичные системы экспрессии могут быть клинически включены для оценки активности фермента в высоковоспроизводимых условиях для разработки лекарств in vitro. [19] [13] Это работает для минимизации риска для пациента, выступая в качестве альтернативы высокоинвазивным процедурам или возможности развития побочных реакций на лекарства. Анализ активности фермента требует различных систем экспрессии для классификации вариантов фермента. В отличие от других животных, экспрессия функциональных рекомбинантных белков является дорогостоящим процессом, особенно для клеток млекопитающих, из-за низких уровней экспрессии ферментов, способствующих метаболизму лекарств. В результате процессы посттрансляционной модификации различаются между видами и ограничивают точность сравнений. Первым гетерологичным белковым продуктом, выпущенным на рынок, был человеческий инсулин , наиболее известный как Хумулин . Этот продукт был изготовлен с использованием штамма E. coli. Большинство бактерий, включая E. coli, не способны успешно секретировать такие белки, что требует дополнительных этапов сбора клеток, разрушения клеток и выделения продукта перед очисткой белка.
Как и в случае с Хумулином, было достигнуто много успехов в использовании гетерологичной экспрессии для разработки лекарств. Гетерологичная экспрессия посредством клонирования генов, производящих представляющие интерес природные биоактивные продукты, также может быть выражена в системах-хозяевах и масштабирована для производства лекарств. Например, несколько клинически значимых природных продуктов в грибах трудно культивировать в лабораторных условиях. Однако после идентификации соответствующих активных кластеров генов эти гены могут быть клонированы в дрожжи и также экспрессированы для получения представляющего интерес продукта более эффективным с точки зрения затрат и времени способом. Этот метод также может быть использован для открытия новых лекарств. В этом эксперименте ранее неизученные генетические последовательности грибов могут быть охарактеризованы и экспрессированы, что позволяет производить новые природные продукты. [20] Однако с мутагенезом генов в направлении более биологически значимого соединения это может быть затем экспрессировано для получения нового генетически модифицированного продукта. [21]
Другим важным применением гетерологичной экспрессии является скрининг различных препаратов в системе хозяина, а не в более дорогой или сложной для поддержания нативной системе. Примером этого может служить использование Mycobacterium marinum в качестве альтернативной системы хозяина по сравнению с прямым использованием Mycobacterium tuberculosis. M. tuberculosis требует высокого уровня биологической безопасности для скрининга препаратов и имеет медленную скорость роста, что делает процесс дорогим и трудоемким. Поэтому исследователи протестировали близкородственную и менее опасную M. marinum, гетерологичная экспрессия двух активаторов препаратов которой стала точной моделью для тестирования противотуберкулезных препаратов. [22] Примером изучения более целенаправленной лекарственной мишени является гетерологичная экспрессия белков ионных каналов для тестирования различных препаратов сердечных ионных каналов, которые изменяют свою функцию для лечения заболеваний сердца. [23] Аналогичным образом скрининг препаратов может происходить с гетерологичной экспрессией клонированных рецепторов. [24] Преимущества использования гетерологичной экспрессии здесь заключаются в том, что она производит большое количество целевых рецепторов интересующих препаратов и, как правило, неисчерпаема, воспроизводима и недорога. Эти рецепторы затем можно использовать в анализах для проверки эффективности и специфичности связывания лекарств. Более того, полученные рецепторы сами по себе можно использовать в качестве терапевтических средств. Они могут служить приманками для токсинов или избыточных сигнальных молекул и связывать/ослаблять эти молекулы
Рекомбинантная технология также сыграла свою роль в разработке биотоплива. Это было исследовано с использованием систем экспрессии, обнаруженных в бактериях, растениях и дрожжах. В частности, гетерологичная экспрессия ферментов целлюлазы использует целлюлозу , наиболее распространенное сырье в мире. Целлюлолитические ферменты обнаружены в растениях, насекомых, бактериях и грибах, которые помогают в преобразовании биомассы в биотопливо. [25] В частности, целлюлоза гидролизуется с образованием молекул сахара. Например, манипуляция уровнями клеточной экспрессии в целлюлолитических ферментах необходима в грибковых хозяевах для преодоления деградации. Однако биопереработка оказалась сложной в формировании высокопродуктивных белков и требует включения других ферментов. Различные микробные штаммы могут быть объединены для экспрессии ферментов, что приводит к общему увеличению выхода ферментов в экономически жизнеспособном масштабе. [25]
Золотой рис был ГМО, созданным в 2005 году путем гетерологичной экспрессии в качестве гуманитарной попытки решения проблемы дефицита витамина А. Рис Oryza sativa был трансфицирован геном для производства β-каротина, предшественника витамина А, имеющего желто-оранжевый цвет. [26]
Несколько ограничений мешают гетерологичной экспрессии генерировать продукты на экономически целесообразном уровне, что наблюдалось у бактерий, дрожжей и растений. [25] Во-первых, эти методы все еще чрезвычайно дороги по сравнению с естественным производством, часто требуют больше времени для генерации и требуют специальных условий для культуры хозяина и индукции экспрессии. Кроме того, большинство методов все еще не оптимизированы, а некоторые даже имеют более низкую экспрессию, чем нативный организм. Особенно в случае с биосинтетическими генами для природных биологически активных продуктов, представляющих интерес, исследователи обнаружили, что они очень плохо экспрессируются в лабораторных условиях, особенно из-за, как правило, больших размеров генов. [27] Хотя белковые продукты производятся, они часто производятся с очень низким выходом, плохо секретируются из-за низкой растворимости или производят другие нежелательные побочные продукты. Успешные примеры гетерологичного производства целевых продуктов в первую очередь наблюдаются с генами низкой сложности с небольшим количеством оперонов. Это часто происходит из-за несоответствия в регуляционных и экспрессионных индукционных путях и механизмах и отражается в наблюдаемой деградации определенных аминокислотных последовательностей, сниженной удельной активности, неправильной мембранной транспортировке и эффектах гликозилирования. Кроме того, существуют барьеры в процессе трансляции, где эффекты тРНК хозяина снижают эффективность трансляции, в частности, распознавание рибосомами хозяина. Аналогичным образом, модификации оснований, связанных с тРНК, которые отличаются от системы хозяина, могут снизить трансляцию белков количественно и качественно. Например, трансляция чужеродного гена в другой системе хозяина, которая не содержала требуемой тРНК, привела к ранней терминации на кодоне, где тРНК отсутствовала. В совокупности, при гетерологичной экспрессии, когда системы трансляции хозяина отличаются от нативной системы, из которой вводятся гены, часто возникают ошибки кодирования, сдвиги рамки или преждевременная или неправильная терминация последовательности. Следовательно, это приводит к более низкому выходу функциональных белков или непреднамеренной сверхэкспрессии белка. Эти ошибки особенно заметны при значительном и неестественном увеличении спроса на биологические механизмы системы хозяина. Часто это приводит к перераспределению клеточных ресурсов от нормальных процессов к производству гетерологичного белка. В частности, это напрягает тРНК и поставку аминокислот, системы контроля качества и системы секреции, а также НАДФН, необходимые для анаболических процессов. Более того, неестественное накопление гетерологичного белка также приводит к неблагоприятным эффектам для хозяина. [28] В целом последствия очевидны не только в низком выходе продукта, но и в реакциях хозяина на стресс и сниженной жизнеспособности хозяина.
Существует много областей активных исследований, посвященных этим ограничениям использования гетерологичной экспрессии, особенно в коммерческих условиях. Один из подходов заключается в определении оптимальной системы-хозяина для каждого конкретного целевого белкового продукта, поскольку различные, особенно ненативные белки, часто имеют девиантное поведение в других организмах, и некоторые системы-хозяева могут давать более высокие урожаи или требовать более мягких условий, чем другие. В частности, интерес представляет включение различных промоторов или оптимизированных генетических последовательностей и использование вариантов или штаммов организмов, которые допускают эти посттрансляционные модификации. Например, варианты с эффективной секрецией могут позволить производить гетерологичные продукты экспрессии, которые будут промышленно значимыми. Кроме того, увеличение доступности кофакторов, улучшение способности к сворачиванию белка, улучшение генных промоторов и разработка систем управления, которые изменяются в зависимости от различных потребностей в ресурсах. Другой подход заключается в включении переходных периодов, когда гетерологичная продукция снижается, чтобы обеспечить восстановление системы-хозяина. Для устранения ошибок в трансляции можно сверхэкспрессировать тРНК, чтобы смягчить любые недостатки, однако модификации оснований по-прежнему сильно зависят от системы-хозяина. [28] Ученые попытались разработать универсальную систему, чтобы попытаться смягчить эти опасения, но еще многое предстоит узнать о связи между хозяевами и нативными производителями, а также о последствиях возросшей нагрузки на системы-хозяева.
Достижения в области технологии рекомбинантной ДНК произвели революцию в идее лечения заболеваний путем реконструкции или замены дефектных генов. Генная терапия — это метод, при котором нормальные гены трансплантируются в клетки, содержащие отсутствующие или дефектные гены, для исправления генетических нарушений. Тем не менее, было высказано несколько опасений относительно эффективности генной терапии из-за ее ограниченного успеха в клинических испытаниях. [29] [30] На протяжении многих лет были приложены огромные усилия для полного понимания векторов, вирусов и их связи с иммунной системой хозяина. Однако не каждая система защиты реагирует одинаково. У некоторых пациентов наблюдалась «аутоиммуноподобная» реакция, когда их организм отвергал это лечение. Гетерологичные гены распознаются как чужеродные для хозяина и могут вызывать опосредованные цитокинами воспалительные реакции, которые в конечном итоге уничтожаются их цитотоксическими Т-клетками. Это поставило под сомнение связь между дозировкой вектора и клеточной токсичностью, поскольку ученые признают, что неправильная активация этих реакций может вызывать серьезные побочные эффекты не только для инфицированных болезнью клеток, но и для других здоровых частей тела. [29]
Генетическая модификация, используемая для решения проблем, выходящих за рамки медицинских потребностей, таких как цвет глаз, спортивные способности, интеллект и т. д., является одним из примеров, который ставит под сомнение этичность ее цели. [31] Евгеника , которая ставит одну группу желаемых человеческих характеристик выше другой, привела к опасениям потенциальной негативной реакции по отношению к генетически модифицированным или генетически немодифицированным лицам в обществе. В случае редактирования зародышевой линии нет гарантии, что лечение обеспечит абсолютное излечение на протяжении всей жизни пациента и/или что эти гены могут быть переданы его потомству. [32] Хотя CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) — метод, позволяющий легко редактировать гены, может представлять определенные преимущества, но он также может вызывать дополнительные риски для человеческого организма. Например, могут быть технические ограничения для редактирования CRISPR. Пока не будут достигнуты успехи, которые полностью вооружат ученых знаниями для понимания всех потенциальных преимуществ и рисков, связанных с редактированием CRISPR, сохраняются опасения относительно безопасности его применения. [32] Возможность того, что редактирование может привести к неполной или неточной генетической последовательности, была отмечена в нескольких экспериментах, связанных с исследованиями линий клеток как животных, так и человека. [32] Поскольку практически невозможно с уверенностью предсказать благоприятный результат, этот метод еще больше затрудняет продвижение редактирования зародышевой линии в качестве надежного средства лечения для людей, страдающих неизлечимыми заболеваниями.
{{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка )