Дитиотреитол ( ДТТ ) — это сероорганическое соединение с формулой (CH(OH)CH 2 SH) 2 . Бесцветное соединение, классифицируется как дитиол и диол . ДТТ — это окислительно-восстановительный реагент, также известный как реагент Клеланда , в честь У. Уоллеса Клеланда . [2] Реагент обычно используется в рацемической форме. Его название происходит от четырехуглеродного сахара , треозы . ДТТ имеет эпимерное («сестринское») соединение, дитиоэритритол (ДТЭ).
Традиционный путь получения дитиотреитола (и его изомера дитиоэритрита) — сульфидирование чрезвычайно слезоточивого 1,4-дибромбут-2-ена . Современные промышленные синтезы вместо этого используют родственные эпоксиды и сероводород. [3]
DTT является восстановителем ; после окисления он образует стабильное шестичленное кольцо с внутренней дисульфидной связью . Он имеет окислительно-восстановительный потенциал −0,33 В при pH 7. [1] Восстановление типичной дисульфидной связи происходит посредством двух последовательных реакций обмена тиол-дисульфид и проиллюстрировано ниже. Восстановление обычно не останавливается на смешанных дисульфидных видах, поскольку второй тиол DTT имеет высокую склонность замыкать кольцо, образуя окисленный DTT и оставляя восстановленную дисульфидную связь . Восстановительная способность DTT ограничена значениями pH выше 7, поскольку только отрицательно заряженная тиолатная форма -S − является реакционноспособной (протонированная тиоловая форма -SH не является); pKa тиоловых групп составляет 9,2 и 10,1.
DTT используется в качестве восстанавливающего или «снимающего защиту» агента для тиолированной ДНК. Концевые атомы серы тиолированной ДНК имеют тенденцию образовывать димеры в растворе, особенно в присутствии кислорода. Димеризация значительно снижает эффективность последующих реакций связывания, таких как иммобилизация ДНК на золоте в биосенсорах. Обычно DTT смешивают с раствором ДНК и дают ему прореагировать, а затем удаляют фильтрацией (для твердого катализатора) или хроматографией (для жидкой формы). Процедуру удаления DTT часто называют «обессоливанием». Обычно DTT используется в качестве защитного агента, который предотвращает окисление тиоловых групп .
DTT часто используется для восстановления дисульфидных связей белков и, в более общем плане, для предотвращения образования внутримолекулярных и межмолекулярных дисульфидных связей между остатками цистеина белков. Однако даже DTT не может восстановить скрытые (недоступные для растворителя) дисульфидные связи, поэтому восстановление дисульфидных связей иногда проводят в денатурирующих условиях (например, при высоких температурах или в присутствии сильного денатуранта, такого как 6 М гуанидинхлорид , 8 М мочевина или 1% додецилсульфат натрия ). DTT часто используется вместе с додецилсульфатом натрия в SDS-PAGE для дальнейшей денатурации белков путем восстановления их дисульфидных связей, чтобы обеспечить лучшее разделение белков во время электрофореза . Благодаря способности восстанавливать дисульфидные связи DTT можно использовать для денатурации CD38 на эритроцитах. DTT также денатурирует антигены в системах групп крови Kell, Lutheran, Dombrock, Cromer, Cartwright, LW и Knops. Наоборот, воздействие растворителя на различные дисульфидные связи можно оценить по скорости их восстановления в присутствии DTT.
DTT также может использоваться в качестве окислителя . Его главное преимущество заключается в том, что фактически не заселяются смешанные дисульфидные виды, в отличие от других агентов, таких как глутатион . В очень редких случаях может образовываться аддукт DTT , т. е. два атома серы DTT могут образовывать дисульфидные связи с различными атомами серы; в таких случаях DTT не может циклизоваться, поскольку у него нет таких оставшихся свободных тиолов.
DTT окисляется воздухом. Поэтому его обычно хранят и обрабатывают в инертной атмосфере, чтобы минимизировать окисление. Скорость окисления воздухом ниже при низких температурах. [4] Окисленный DTT демонстрирует сильный пик поглощения при 280 нм. Поскольку тиолы менее нуклеофильны, чем их сопряженные основания, тиоляты , DTT становится менее сильным нуклеофилом по мере снижения pH. (2 S )-2-амино-1,4-димеркаптобутан ( дитиобутиламин или DTBA), родственный дитиоловый восстанавливающий агент, несколько преодолевает это ограничение DTT. [5] Трис(2-карбоксиэтил)фосфин ( TCEP ) является альтернативным восстанавливающим агентом, который более стабилен и эффективен при низком pH, но он громоздкий и восстанавливает цистины в сложенных белках только медленно. [6]
Период полураспада DTT составляет 40 часов при pH 6,5 и 1,4 часа при pH 8,5 и 20 °C; его период полураспада еще больше уменьшается с ростом температуры. Присутствие EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты) для хелатирования двухвалентных ионов металлов значительно продлевает период полураспада DTT в растворе. [7]
Медиа, связанные с Дитиотреитолом на Wikimedia Commons