Дифференциально-интерференционный контраст ( DIC ) микроскопия , также известная как интерференционный контраст Номарского ( NIC ) или микроскопия Номарского , представляет собой метод оптической микроскопии, используемый для усиления контраста в неокрашенных прозрачных образцах . DIC работает по принципу интерферометрии , чтобы получить информацию о длине оптического пути образца, чтобы увидеть иначе невидимые особенности. Относительно сложная оптическая система создает изображение, на котором объект выглядит черным или белым на сером фоне. Это изображение похоже на то, что получается с помощью фазово-контрастной микроскопии, но без яркого дифракционного гало. Метод был изобретен Фрэнсисом Хьюзом Смитом. [1] [ необходима цитата ] «Smith DIK» был произведен Эрнстом Лейтцем Вецларом в Германии и был сложен в производстве. Затем DIC был доработан польским физиком Жоржем Номарским в 1952 году. [2]
DIC работает путем разделения поляризованного источника света на две ортогонально поляризованные взаимно когерентные части, которые пространственно смещены (сдвинуты) в плоскости образца и рекомбинируются перед наблюдением. Интерференция двух частей при рекомбинации чувствительна к их оптической разности хода (т. е. произведению показателя преломления и геометрической длины пути). Добавляя регулируемую фазу смещения, определяющую интерференцию при нулевой оптической разности хода в образце, контраст пропорционален градиенту длины пути вдоль направления сдвига, создавая видимость трехмерного физического рельефа, соответствующего изменению оптической плотности образца, подчеркивая линии и края, хотя и не обеспечивая топографически точного изображения.
1. Неполяризованный свет попадает в микроскоп и поляризуется под углом 45°.
2. Поляризованный свет поступает в первую призму Волластона, модифицированную Номарским , и разделяется на два луча, поляризованных под углом 90° друг к другу: выборочный и опорный лучи.
3. Два луча фокусируются конденсором для прохождения через образец. Эти два луча фокусируются так, чтобы они проходили через две соседние точки в образце, на расстоянии около 0,2 мкм друг от друга.
4. Лучи проходят через смежные области образца, разделенные сдвигом. Разделение обычно аналогично разрешению микроскопа. Они будут испытывать разные оптические длины пути, где области отличаются по показателю преломления или толщине. Это вызывает изменение фазы одного луча относительно другого из-за задержки, испытываемой волной в более оптически плотном материале.
5. Лучи проходят через объективную линзу и фокусируются для второй модифицированной Номарским призмы Волластона.
6. Вторая призма рекомбинирует два луча в один, поляризованный под углом 135°. Объединение лучей приводит к интерференции , осветляя или затемняя изображение в этой точке в соответствии с оптической разностью хода.
Изображение имеет вид трехмерного объекта при очень косом освещении, вызывающем сильный свет и темные тени на соответствующих гранях. Направление видимого освещения определяется ориентацией призм Волластона.
Как объяснялось выше, изображение формируется из двух идентичных изображений светлого поля, наложенных друг на друга с небольшим смещением (обычно около 0,2 мкм), и последующей интерференции из-за разности фаз, преобразующей изменения фазы (и, следовательно, длины оптического пути) в видимое изменение темноты. Эта интерференция может быть как конструктивной, так и деструктивной, что приводит к характерному появлению трех измерений.
Типичная разность фаз, вызывающая интерференцию, очень мала, очень редко превышая 90° (четверть длины волны). Это связано со схожестью показателя преломления большинства образцов и сред, в которых они находятся: например, клетка в воде имеет разность показателей преломления всего около 0,05. Эта небольшая разность фаз важна для правильной работы DIC, поскольку если разность фаз на стыке двух веществ слишком велика, то разность фаз может достичь 180° (половины длины волны), что приведет к полной деструктивной интерференции и аномальной темной области; если разность фаз достигнет 360° (полной длины волны), это приведет к полной конструктивной интерференции, создав аномальную яркую область.
Изображение можно аппроксимировать (пренебрегая рефракцией и поглощением, обусловленными образцом, а также пределом разрешения разделения пучков) как дифференциал длины оптического пути относительно положения поперек образца вдоль сдвига, а значит, как дифференциал показателя преломления (оптической плотности) образца.
Контрастность можно регулировать с помощью смещения фазы, либо путем перемещения объективной призмы Номарского, либо с помощью волновой пластины лямбда/4 между поляризатором и конденсорной призмой Номарского (компенсация Де-Сенармона). Результирующий контраст переходит от темного поля для нулевого смещения фазы (интенсивность пропорциональна квадрату дифференциала сдвига), к типичному рельефу, наблюдаемому для фазы ~5–90 градусов, к оптическому окрашиванию на 360 градусов, где погашенная длина волны смещается вместе с дифференциалом фазы.
При сопоставлении последовательно смещенных изображений сдвиг фазы, вносимый объектом, может быть отделен от нежелательных неинтерферометрических артефактов, что обычно приводит к улучшению контрастности, особенно в мутных образцах. [3]
DIC используется для визуализации живых и неокрашенных биологических образцов, таких как мазок из культуры ткани или отдельные водные одноклеточные организмы. Благодаря максимально пространственно некогерентному освещению теоретическое разрешение приближается к теоретическому максимальному покрытию, диктуемому сферой Эвальда . [4] Это улучшение методов, требующих более высокой степени когерентности, таких как фазовый контраст .
Одной из небиологических областей, где используется DIC, является анализ обработки планарных кремниевых полупроводников. Тонкие (обычно 100–1000 нм) пленки в обработке кремния часто в основном прозрачны для видимого света (например, диоксид кремния, нитрид кремния и поликристаллический кремний), и дефекты в них или загрязнения, лежащие поверх них, становятся более заметными. Это также позволяет определить, является ли элемент углублением в материале подложки или каплей инородного материала сверху. Протравленные кристаллические элементы приобретают особенно поразительный вид под DIC.
Качество изображения при использовании в подходящих условиях является выдающимся [ требуется цитата ] по разрешению. Однако анализ изображений DIC всегда должен учитывать ориентацию призм Волластона и видимое направление освещения, поскольку параллельные им особенности не будут видны. Однако это легко преодолеть, просто вращая образец и наблюдая изменения в изображении.