stringtranslate.com

Поликлональные антитела

Поликлональные антитела (pAbs) — это антитела , которые секретируются различными линиями В-клеток в организме (тогда как моноклональные антитела происходят из одной клеточной линии). Они представляют собой набор молекул иммуноглобулина , которые реагируют на определенный антиген , причем каждая из них идентифицирует другой эпитоп .

Производство

Общая процедура получения поликлональных антител выглядит следующим образом:

  1. Приготовление антигена
  2. Выбор и подготовка адъюванта
  3. Отбор животных
  4. Процесс инъекции
  5. Извлечение сыворотки крови

Конъюгат антиген/адъювант вводится животному по выбору для инициирования усиленного иммунного ответа. После серии инъекций в течение определенного периода времени ожидается, что у животного выработаются антитела против конъюгата. Затем кровь извлекается из животного и очищается для получения интересующего антитела.

Инокуляция проводится на подходящем млекопитающем , таком как мышь, кролик или коза. Более крупные млекопитающие часто являются предпочтительными, поскольку количество сыворотки , которое можно собрать, больше. Антиген вводится млекопитающему. Это побуждает В- лимфоциты вырабатывать иммуноглобулины IgG, специфичные для антигена. Этот поликлональный IgG очищается из сыворотки млекопитающего .

Напротив, моноклональные антитела получают из одной линии клеток.

Существует множество методик для производства поликлональных антител у лабораторных животных. Институциональные руководящие принципы, регулирующие использование животных и процедуры, связанные с этими методиками, в целом ориентированы на гуманные соображения и соответствующее поведение при использовании адъювантов (агентов, которые изменяют действие других агентов, при этом не оказывая прямого воздействия при введении их самостоятельно). Это включает выбор адъювантов, пути и места введения, объемы инъекций на место и количество мест на животное. Институциональные политики обычно включают допустимые объемы крови на сбор и меры предосторожности, включая соответствующее ограничение и седацию или анестезию животных для предотвращения травм животных или персонала.

Основная цель производства антител у лабораторных животных — получение антисывороток с высоким титром и высоким сродством для использования в экспериментах или диагностических тестах. Адъюванты используются для улучшения или усиления иммунного ответа на антигены. Большинство адъювантов обеспечивают место инъекции, депо антигена, что позволяет медленно высвобождать антиген в дренирующие лимфатические узлы.

Многие адъюванты также содержат или действуют непосредственно как:

  1. поверхностно-активные вещества, которые способствуют концентрации молекул белковых антигенов на большой площади поверхности, и
  2. Иммуностимулирующие молекулы или свойства. Адъюванты обычно используются с растворимыми белковыми антигенами для повышения титров антител и индукции длительного ответа с сопутствующей памятью.

Такие антигены сами по себе, как правило, являются слабыми иммуногенами. Большинство сложных белковых антигенов индуцируют множественные клоны В-клеток во время иммунного ответа, таким образом, ответ является поликлональным. Иммунные ответы на небелковые антигены, как правило, слабы или усиливаются адъювантами, и системная память отсутствует.

В настоящее время антитела также производятся путем изоляции человеческих В-лимфоцитов для получения специфических рекомбинантных моноклональных смесей антител. Биотехнологическая компания Symphogen разрабатывает этот тип антител для терапевтического применения. Они являются первой исследовательской компанией, которая достигла второй фазы испытаний смесей моноклональных антител, которые имитируют разнообразие препаратов поликлональных антител. Такое производство предотвращает передачу вирусов и прионов, и это простой процесс.

Отбор животных

Животные, часто используемые для производства поликлональных антител, включают кур, коз, морских свинок, хомяков, лошадей, мышей, крыс и овец. Однако кролик является наиболее часто используемым лабораторным животным для этой цели. Выбор животных должен основываться на:

  1. необходимое количество антител,
  2. взаимосвязь между донором антигена и реципиентом-производителем антител (как правило, чем более отдаленные филогенетическое родство, тем выше потенциал для реакции антител с высоким титром) и
  3. необходимые характеристики [например, класс, подкласс (изотип), комплемент-фиксирующая природа] антител, которые должны быть созданы. Иммунизация и флеботомия связаны со стрессом, и, по крайней мере, при использовании кроликов и грызунов предпочтительны животные, свободные от специфических патогенов (SPF). Использование таких животных может значительно снизить заболеваемость и смертность из-за патогенных организмов, особенно Pasteurella multocida у кроликов.

Козы или лошади обычно используются, когда требуются большие количества антисыворотки. Многие исследователи отдают предпочтение курам из-за их филогенетической удаленности от млекопитающих. Куры переносят большие количества IgY (IgG) в яичный желток, и сбор антител из яиц устраняет необходимость в инвазивной процедуре взятия крови. Однонедельные яйца могут содержать в 10 раз больше антител, чем объем крови кролика, полученный при одном еженедельном взятии крови. Однако существуют некоторые недостатки при использовании определенных антител, полученных от кур, в иммуноанализах. Куриный IgY не фиксирует компонент комплемента млекопитающих C1 и не действует как преципитирующее антитело при использовании стандартных растворов.

Хотя мыши чаще всего используются для производства моноклональных антител, их малый размер обычно не позволяет использовать их для достаточного количества поликлональных сывороточных антител. Однако поликлональные антитела у мышей можно собрать из асцитической жидкости, используя любую из множества методик получения асцита.

При использовании кроликов для первичной иммунизации следует использовать молодых взрослых животных (2,5–3,0 кг или 5,5–6,5 фунтов) из-за сильной реакции антител. Иммунная функция достигает пика в период полового созревания , а первичные реакции на новые антигены снижаются с возрастом. Обычно предпочитают самок кроликов, поскольку они более послушны и, как сообщается, вызывают более сильную иммунную реакцию, чем самцы. При использовании беспородных животных следует использовать не менее двух животных на антиген. Этот принцип снижает потенциальную общую неудачу в результате отсутствия реакции на антигены отдельных животных.

Приготовление антигена

Размер, степень агрегации и относительная нативность белковых антигенов могут существенно влиять на качество и количество продуцируемых антител. Малые полипептиды (< 10  кДа ) и небелковые антигены обычно необходимо конъюгировать или сшивать с более крупными иммуногенными белками-носителями для повышения иммуногенности и предоставления эпитопов Т-клеток . Как правило, чем больше иммуногенный белок, тем лучше. Более крупные белки, даже в меньших количествах, обычно приводят к лучшему взаимодействию антигенпрезентирующих клеток, обрабатывающих антиген, для удовлетворительного иммунного ответа. Инъекция растворимых неагрегированных белков имеет более высокую вероятность индукции толерантности, а не удовлетворительного ответа антител.

Гемоцианин лимфы улитки (KLH) и бычий сывороточный альбумин являются двумя широко используемыми белками-носителями. Поли-L-лизин также успешно использовался в качестве основы для пептидов. Хотя использование поли-L-лизина снижает или устраняет выработку антител к чужеродным белкам, это может привести к сбою выработки антител, индуцированной пептидом. В последнее время липосомы также успешно используются для доставки небольших пептидов, и этот метод является альтернативой доставке с использованием масляных эмульсионных адъювантов.

Количество антигена

Выбор количества антигена для иммунизации зависит от свойств антигена и выбранного адъюванта. В общем, для получения антител с высоким титром необходимо количество белка в адъюванте от микрограмма до миллиграмма. Дозировка антигена обычно связана с видом, а не с массой тела. Так называемое «окно» иммуногенности у каждого вида широкое, но слишком много или слишком мало антигена может вызвать толерантность, подавление или иммунное отклонение в сторону клеточного иммунитета, а не удовлетворительного гуморального ответа. Оптимальные и обычные уровни белкового антигена для иммунизации определенных видов были зарегистрированы в следующих диапазонах:

  1. кролик, 50–1000 мкг;
  2. мышь, 10–50 мкг;
  3. морская свинка, 50–500 мкг; и
  4. коза, 250–5000 мкг.

Сообщается, что оптимальные «прайминговые» дозы находятся на нижнем пределе каждого диапазона.

Сродство сывороточных антител увеличивается со временем (месяцы) после инъекции смесей антиген-адъювант и по мере уменьшения антигена в системе. Широко используемые дозировки антигена для «бустерной» или вторичной иммунизации обычно составляют половину от дозировок первичной иммунизации. Антигены не должны содержать побочных продуктов и химикатов, таких как полиакриламидный гель, SDS, мочевина, эндотоксин, твердые частицы и экстремальные значения pH.

Антитела к пептидам

Когда пептид используется для генерации антитела, крайне важно правильно спроектировать антигены. Существует несколько ресурсов, которые могут помочь в разработке, а также компании, которые предлагают эту услугу. Expasy собрала набор общедоступных инструментов на своей странице ProtScale, для навигации по которым требуется некоторая степень знаний пользователя. Для более простого инструмента оценки пептидов доступен инструмент Antigen Profiler, который позволит вам оценивать отдельные последовательности пептидов на основе базы данных картирования эпитопов отношений предыдущих иммуногенов, использованных для генерации антител. Наконец, как общее правило, пептиды должны соответствовать некоторым основным критериям.

При изучении пептидов для синтеза и иммунизации рекомендуется избегать определенных остатков и последовательностей из-за потенциальных проблем синтеза. Это включает некоторые из наиболее распространенных характеристик:

Реактивность

Исследователи также должны учитывать статус нативности белковых антигенов при использовании в качестве иммуногенов и реакцию с полученными антителами. Антитела к нативным белкам лучше всего реагируют с нативными белками, а антитела к денатурированным белкам лучше всего реагируют с денатурированными белками. Если вызванные антитела будут использоваться на мембранных блотах (белки, подвергнутые денатурирующим условиям), то антитела должны быть получены против денатурированных белков. С другой стороны, если антитела будут использоваться для реакции с нативным белком или блокирования активного центра белка, то антитела должны быть получены против нативного белка. Адъюванты часто могут изменять нативность белка. Как правило, абсорбированные белковые антигены в предварительно сформированном адъюванте эмульсии типа «масло в воде » сохраняют большую нативную структуру белка, чем в эмульсиях типа «вода в масле».

Асептичности

Антигены всегда следует готовить с использованием методов, которые гарантируют отсутствие микробного загрязнения. Большинство препаратов белковых антигенов можно стерилизовать путем пропускания через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Септические абсцессы часто возникают в местах инокуляции животных при использовании загрязненных препаратов. Это может привести к неудаче иммунизации против целевого антигена.

Адъюванты

Существует множество коммерчески доступных иммунологических адъювантов . Выбор конкретных адъювантов или типов варьируется в зависимости от того, будут ли они использоваться для исследований и производства антител или для разработки вакцин. Адъюванты для использования в вакцинах должны вырабатывать только защитные антитела и хорошую системную память, в то время как адъюванты для производства антисыворотки должны быстро индуцировать высокий титр, высокую авидность антител. Ни один адъювант не является идеальным для всех целей, и все они имеют свои преимущества и недостатки. Использование адъювантов, как правило, сопровождается нежелательными побочными эффектами различной степени тяжести и продолжительности. Исследования новых адъювантов фокусируются на веществах, которые имеют минимальную токсичность, сохраняя при этом максимальную иммуностимуляцию. Исследователи всегда должны помнить о потенциальной боли и стрессе, связанных с использованием адъювантов у лабораторных животных.

Наиболее часто используемыми адъювантами для производства антител являются адъювант Фрейнда, квасцы, система адъювантов Риби и Titermax.

Фармацевтическое применение

Digoxin Immune Fab — это антигенсвязывающий фрагмент поликлональных антител, полученных к производному наперстянки в виде гаптена, связанного с белком, и используемый для устранения опасной для жизни токсичности дигоксина или дигитоксина . [1] [2] [3]

Иммуноглобулин Rho(D) производится из объединенной человеческой плазмы, предоставленной резус-отрицательными донорами с антителами к антигену D. Он используется для обеспечения пассивного иммунного связывания антигена, предотвращая активный иммунный ответ матери, который может потенциально привести к гемолитической болезни новорожденного . [4] [5]

Розролимупаб — это рекомбинантное поликлональное антитело человека против RhD , состоящее из 25 уникальных антител IgG1 , которое применяется для лечения иммунной тромбоцитопенической пурпуры и профилактики изоиммунизации у резус-отрицательных беременных женщин.

REGN-COV2 ( Regeneron Pharmaceuticals ) – потенциальное средство лечения людей с COVID-19 и профилактики заражения коронавирусом SARS-CoV-2 .

Преимущества

Использование поликлональных антител (pAbs) по сравнению с моноклональными антителами имеет свои преимущества. Технические навыки, необходимые для производства поликлональных антител, не столь требовательны. Они недороги в производстве и могут быть получены довольно быстро, на их производство уходит до нескольких месяцев. PAbs являются гетерогенными, что позволяет им связываться с широким спектром эпитопов антигенов. Поскольку PAbs производятся из большого количества клонов В-клеток, они с большей вероятностью успешно связываются с определенным антигеном. PAbs остаются стабильными в различных средах, таких как изменение pH или концентрации соли, что позволяет им быть более применимыми в определенных процедурах. Кроме того, в зависимости от необходимого количества, PAbs можно производить в больших количествах по отношению к размеру используемого животного. [6] [7] [8]

Недостатки

Использование поликлональных антител по сравнению с моноклональными антителами имеет недостатки. В основном это касается аспекта воспроизводимости. [9] pAbs генерируются в результате иммунного ответа на антиген. Отдельное животное или человек будет генерировать разные антитела против одного и того же антигена. В случае многократного воздействия одного и того же антигена смесь pAbs будет отличаться с течением времени. Эта так называемая вариабельность «от партии к партии» является одной из самых больших проблем при использовании pAbs.

Рекомбинантные поликлональные антитела

Несмотря на недостатки, широкое распознавание эпитопов поликлональных антител [10] и более высокая чувствительность [11] являются ключевыми для различных приложений. Ученые используют смеси моноклональных антител (mAbs) для имитации pAbs. Рекомбинантное производство mAbs решило проблемы изменчивости и воспроизводимости в pAbs. Смесь многих mAbs будет имитировать более широкое распознавание эпитопов pAbs и более высокую чувствительность. [12] Недавние достижения в области технологий позволили проводить прямое секвенирование белков поликлональных антител от человека и иммунизированных животных. [13] [14] Затем эти белки антител можно рекомбинантно производить для имитации исходных pAbs, вырабатываемых иммунной системой.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ "Digibind (Digoxin Immune Fab): побочные эффекты, применение, дозировка, взаимодействия, предупреждения". RxList . Архивировано из оригинала 2024-07-02 . Получено 2024-07-02 .
  2. ^ "DIGIBIND®DIGOXIN IMMUNE FAB (OVINE)". dailymed.nlm.nih.gov . Архивировано из оригинала 2021-10-28 . Получено 2024-07-02 .
  3. ^ "DIGIFAB DIGOXIN IMMUNE FAB (OVINE)". Управление по контролю за продуктами и лекарствами . Архивировано из оригинала 20 июля 2023 г. Получено 12 июля 2024 г.
  4. ^ Гемолитическая болезнь новорожденных — группы крови и антигены эритроцитов Архивировано 05.01.2020 на Wayback Machine , книжная полка NCBI
  5. ^ Женская донорская кровь дает спасительный RhoGAM Архивировано 27.06.2009 в Wayback Machine . USAToday.com
  6. ^ "Критические шаги в производстве поликлональных и моноклональных антител: оценка и рекомендации". Журнал ILAR . 46. Архивировано из оригинала 27.11.2013.
  7. ^ Suckow, Mark A.; Stevens, Karla A.; Wilson, Ronald P. (2012). Лабораторный кролик, морская свинка, хомяк и другие грызуны. Academic Press. ISBN 978-0123809209. Архивировано из оригинала 2024-07-12 . Получено 2022-05-09 .
  8. ^ "Моноклональные и поликлональные антитела: отличительные характеристики, применение и информационные ресурсы". Журнал ILAR . 46. Архивировано из оригинала 2014-03-17.
  9. ^ Брэдбери, Эндрю; Плюктун, Андреас (2015). «Воспроизводимость: стандартизация антител, используемых в исследованиях». Nature . 518 (7537): 27–29. Bibcode :2015Natur.518...27B. doi :10.1038/518027a. PMID  25652980.
  10. ^ «Моноклональные и поликлональные антитела: отличительные характеристики, применение и информационные ресурсы».
  11. ^ «Критические этапы в производстве поликлональных и моноклональных антител: оценка и рекомендации».
  12. ^ Wayham, Nicholas P.; Niedecken, Ariel R.; Simons, Jan Fredrik; Chiang, Yao Y.; Medina-Cucurella, Angélica V.; Mizrahi, Rena A.; Wagner, Ellen K.; Gras, Ashley; Segal, Ilana; Witte, Peyton; Enstrom, Alexis; Bountouvas, Aristea; Nelson, Sabrina M.; Weinberger, Tess; Tan, David; Asensio, Michael A.; Subramanian, Alagu; Lim, Yoong Wearn; Adler, Adam S.; Keating, Sheila M. (2023). «Мощное рекомбинантное поликлональное антитело для защиты от новых вариантов коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2, вызывающих беспокойство». Журнал инфекционных заболеваний . 228 (5): 555–563. doi : 10.1093/infdis/jiad102. PMC 10469345. PMID  37062677 . 
  13. ^ «В темный сывороточный протеом: персонализированные особенности репертуаров IgG1 и IgA1 у пациентов с тяжелой формой COVID-19».
  14. ^ Le Bihan, Thierry; Nunez De Villavicencio Diaz, Teresa; Reitzel, Chelsea; Lange, Victoria; Park, Minyoung; Beadle, Emma; Wu, Lin; Jovic, Marko; Dubois, Rosalin M.; Couzens, Amber L.; Duan, Jin; Han, Xiaobing; Liu, Qixin; Ma, Bin (2024). «Секвенирование белков de novo антител для идентификации нейтрализующих антител в плазме человека после вакцинации против SARS-CoV-2». Nature Communications . 15 (1): 8790. Bibcode :2024NatCo..15.8790L. doi :10.1038/s41467-024-53105-8. PMC 11466954 . PMID  39389968. 

Внешние ссылки