stringtranslate.com

Обращенно-фазовая хроматография

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография ( ОФ-ЖХ ) — это режим жидкостной хроматографии , в котором для разделения органических соединений используются неполярная неподвижная фаза и полярные подвижные фазы . [1] [2] [3] Подавляющее большинство разделений и анализов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в последние годы выполняются с использованием обращенно-фазового режима. В обращенно-фазовом режиме компоненты пробы удерживаются в системе, тем более гидрофобными они являются. [4]

Факторы, влияющие на удерживание и разделение растворенных веществ в обращенно-фазовой хроматографической системе, следующие:

а. Химическая природа неподвижной фазы , т. е. лигандов, связанных на ее поверхности, а также плотность их связи, а именно степень их покрытия.

б. Состав подвижной фазы . Тип объемных растворителей, смеси которых влияют на полярность подвижной фазы, отсюда и название модификатора растворителя, добавляемого для воздействия на полярность подвижной фазы.

C. Добавки, такие как буферы, влияют на pH подвижной фазы , что влияет на состояние ионизации растворенных веществ и их полярность.

Для удержания органических компонентов в смесях неподвижные фазы, упакованные внутри колонок, состоят из гидрофобных подложек, связанных с поверхностью пористых частиц силикагеля различной геометрии (сферические, неправильные), разного диаметра (менее 2 , 3, 5, 7, 10 мкм) с различным диаметром пор (60, 100, 150, 300, А). Поверхность частицы покрыта химически связанными углеводородами , такими как C3, C4, C8, C18 и другими. Чем дольше углеводород связан с неподвижной фазой, тем дольше будут сохраняться компоненты пробы. Некоторые неподвижные фазы также состоят из гидрофобных полимерных частиц или частиц гибридизированных диоксида кремния и органических групп, в методе, в котором используются подвижные фазы при экстремальных значениях pH. В большинстве современных методов разделения биомедицинских материалов используются колонки C-18, иногда называемые торговыми названиями, например ODS (октадецилсилан) или RP-18. 

Подвижные фазы представляют собой смеси воды и полярных органических растворителей, подавляющее большинство из которых — метанол и ацетонитрил . Эти смеси обычно содержат различные добавки, такие как буферы ( ацетат , фосфат , цитрат ), поверхностно-активные вещества (алкиламины или алкилсульфонаты ) и специальные добавки ( ЭДТА ). Целью использования добавок того или иного типа является повышение эффективности, селективности и контроля удержания растворенных веществ. 

Стационарные фазы

Идеализированный рисунок силикагеля до и после обработки октадецилтрихлорсиланом ( C 18 H 37 SiCl 3 ) . Большинство силанольных групп (красные) превращаются в гидрофобные алкилсилоксигруппы. [5]

История и эволюция обращенно-фазовых стационарных фаз подробно описаны в статье Мейджорса, Долана, Карра и Снайдера. [6]

В 1970-х годах большинство анализов жидкостной хроматографии выполнялось с использованием твердых частиц в качестве неподвижных фаз, изготовленных из немодифицированного силикагеля или оксида алюминия . Этот тип метода теперь называется нормально-фазовой хроматографией . Поскольку в этом методе неподвижная фаза гидрофильна , а подвижная фаза неполярна (состоит из органических растворителей, таких как гексан и гептан), биомолекулы с гидрофильными свойствами в образце сильно адсорбируются на неподвижной фазе. Более того, они с трудом растворялись в растворителях подвижной фазы. В то же время гидрофобные молекулы испытывают меньшее сродство к полярной неподвижной фазе и элюируются через нее раньше, не обладая достаточным удерживанием. Это было причиной того, что в 1970-х годах частицы на основе диоксида кремния обрабатывались углеводородами, иммобилизовались или связывались на их поверхности, а подвижные фазы были заменены водными и полярными по своей природе для размещения биомедицинских веществ.

Использование гидрофобной неподвижной фазы и полярных подвижных фаз по сути является противоположностью нормально-фазовой хроматографии, поскольку полярность подвижной и неподвижной фаз инвертирована - отсюда и термин обращенно-фазовая хроматография. [7] [8] В результате гидрофобные молекулы в полярной подвижной фазе имеют тенденцию адсорбироваться на гидрофобной неподвижной фазе, а гидрофильные молекулы в образце проходят через колонку и элюируются первыми. [7] [9] Гидрофобные молекулы можно элюировать из колонки, уменьшив полярность подвижной фазы с помощью органического (неполярного) растворителя, что уменьшает гидрофобные взаимодействия. Чем более гидрофобна молекула, тем сильнее она будет связываться с неподвижной фазой и тем выше концентрация органического растворителя потребуется для элюирования молекулы.

Многие математические параметры теории хроматографии и экспериментальные соображения, используемые в других хроматографических методах, также применимы к ОФ-ЖХ (например, коэффициент селективности, хроматографическое разрешение, количество тарелок и т. д. Его можно использовать для разделения широкий спектр молекул. Обычно его используют для разделения белков [10] , поскольку органические растворители, используемые в нормально-фазовой хроматографии, могут денатурировать многие белки.

Сегодня RP-LC является часто используемым аналитическим методом. Существует огромное разнообразие неподвижных фаз, доступных для использования в ОФ-ЖХ, что обеспечивает большую гибкость при разработке методов разделения. [11] [12]

Неподвижные фазы на основе кремнезема

Частицы силикагеля обычно используются в качестве неподвижной фазы в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по нескольким причинам, [13] [14], в том числе:

  1. Большая площадь поверхности : частицы силикагеля имеют большую площадь поверхности, что обеспечивает прямое взаимодействие с растворенными веществами или после связывания различных лигандов для разносторонних взаимодействий с молекулами образца, что приводит к лучшему разделению.
  2. Химическая и термическая стабильность и инертность : [15] Силикагель химически стабилен, поскольку он обычно не вступает в реакцию ни с растворителями подвижной фазы, ни с разделяемыми соединениями, что приводит к точным, воспроизводимым и надежным анализам.
  3. Широкая применимость : [16] Силикагель универсален и может быть модифицирован различными функциональными группами, что делает его пригодным для широкого спектра аналитов и применений.
  4. Эффективное разделение : уникальные свойства частиц силикагеля в сочетании с их большой площадью поверхности и контролируемым размером пор среднего диаметра частиц [17] способствуют эффективному и точному разделению соединений при ВЭЖХ.
  5. Воспроизводимость : Частицы силикагеля могут обеспечивать высокую воспроизводимость от партии к партии, что имеет решающее значение для последовательного и надежного анализа ВЭЖХ на протяжении десятилетий.
  6. Контроль диаметра частиц и размера пор : [18] [19] Силикагель может быть спроектирован так, чтобы иметь поры определенного размера, что позволяет точно контролировать разделение в зависимости от размера молекул.
  7. Экономическая эффективность : кремнезем является наиболее распространенным элементом на Земле, поэтому его гель является экономичным выбором для применений ВЭЖХ, что делает его широко распространенным в лабораториях.

Фармакопея США (USP) классифицирует колонки для ВЭЖХ по типам L#. [20] Наиболее популярной колонкой в ​​этой классификации является диоксид кремния, связанный с октадециловой углеродной цепью (C18) (классификация USP L1). [21] За ним следуют кремнезем с C8-связями (L7), чистый кремнезем (L3), кремнезем с циано-связями (CN) (L10) и кремнезем с фенильными связями (L11). Обратите внимание, что C18, C8 и фенил представляют собой стационарные фазы с обращенной фазой, тогда как колонки CN можно использовать в режиме с обращенной фазой в зависимости от аналита и условий подвижной фазы. Не все колонки C18 имеют одинаковые свойства удерживания. Функционализация поверхности кремнезема может быть выполнена в мономерной или полимерной реакции с различными органосиланами с короткой цепью, используемыми на втором этапе для покрытия оставшихся силанольных групп ( концевое блокирование ). Хотя общий механизм удерживания остается прежним, небольшие различия в химическом составе поверхности различных неподвижных фаз приведут к изменениям в селективности.

Современные колонки имеют разную полярность в зависимости от лиганда, связанного с неподвижной фазой. PFP – это пентафторфенил. CN — это циано. NH2 – амино. ODS — это октадецил или C18. ODCN представляет собой колонку смешанного типа, состоящую из C18 и нитрила. [22]

Последние разработки в области хроматографических подставок и приборов для жидкостной хроматографии (ЖХ) облегчают быстрое и высокоэффективное разделение с использованием стационарных фаз различной геометрии. [23] Были предложены различные аналитические стратегии, такие как использование монолитных носителей на основе диоксида кремния, повышенные температуры подвижной фазы и колонки, набитые частицами с поверхностной пористостью размером менее 3 мкм (плавленое или твердое ядро) [24] или с суб- 3 мкм. Полностью пористые частицы размером 2 мкм для использования в системах ЖХ сверхвысокого давления (УВЭЖХ). [25]

Подвижные фазы

Подробная статья о современных тенденциях и передовом опыте выбора подвижной фазы в обращенно-фазовой хроматографии была опубликована Бойсом и Донгом. [26] Подвижная фаза в обращенно-фазовой хроматографии состоит из смесей воды или водных буферов, к которым добавляются органические растворители для селективного элюирования аналитов из обращенно-фазовой колонки. [7] [27] Добавляемые органические растворители должны смешиваться с водой, а двумя наиболее распространенными органическими растворителями являются ацетонитрил и метанол . Также можно использовать другие растворители, такие как этанол или 2-пропанол ( изопропиловый спирт ) и тетрагидрофуран (ТГФ). Органический растворитель также называют модификатором, поскольку его добавляют к водному раствору подвижной фазы для изменения полярности подвижной фазы. Вода является наиболее полярным растворителем в обращенно-фазовой подвижной фазе; следовательно, снижение полярности подвижной фазы за счет добавления модификаторов увеличивает ее силу элюирования. Двумя наиболее широко используемыми органическими модификаторами являются ацетонитрил и метанол, хотя ацетонитрил является более популярным выбором. Также можно использовать изопропанол (2-пропанол) из-за его сильных элюирующих свойств, но его использование ограничено его высокой вязкостью, что приводит к более высокому противодавлению. И ацетонитрил, и метанол менее вязкие, чем изопропанол, хотя смесь метанола и воды в соотношении 50:50 также очень вязкая и вызывает высокое противодавление.

Все три растворителя по существу прозрачны для УФ-излучения. Это важнейшее свойство для обычной обращенно-фазовой хроматографии, поскольку компоненты пробы обычно обнаруживаются УФ-детекторами. Ацетонитрил более прозрачен, чем другие, в диапазоне низких длин волн УФ-излучения, поэтому его используют почти исключительно при разделении молекул со слабыми хромофорами или без них (группы, поглощающие УФ-ВИД), например пептидов. Большинство пептидов поглощают только низкие длины волн ультрафиолетового спектра (обычно менее 225 нм), а ацетонитрил обеспечивает гораздо более низкое фоновое поглощение при низких длинах волн, чем другие распространенные растворители.

pH подвижной фазы может играть важную роль в удерживании аналита и может изменять селективность некоторых аналитов. [28] [29] Для образцов, содержащих растворенные вещества с ионизированными функциональными группами, такими как амины , карбоксилы , фосфаты , фосфонаты , сульфаты и сульфонаты , ионизацию этих групп можно контролировать с помощью буферов для подвижной фазы. [30]

Например, карбоксильные группы в растворенных веществах становятся все более отрицательно заряженными по мере того, как pH подвижной фазы поднимается выше их pKa, следовательно, вся молекула становится более полярной и менее удерживаемой на a-полярной неподвижной фазе. В этом случае повышение pH подвижной фазы выше 4–5 = pH (что является типичным диапазоном pKa для карбоксильных групп) увеличивает их ионизацию и, следовательно, уменьшает их удерживание. И наоборот, использование подвижной фазы при pH ниже 4 [31] увеличит их удерживание, поскольку уменьшится степень их ионизации, что сделает их менее полярными.

Те же соображения применимы и к веществам, содержащим основные функциональные группы, например аминам, диапазоны рКа которых составляют около 8 и выше, сохраняются больше по мере увеличения рН подвижной фазы, приближаясь к 8 и выше, поскольку они менее ионизированы, следовательно, менее полярный. Однако в случае подвижных фаз с высоким pH большинство традиционных колонок с обращенной фазой на основе силикагеля обычно ограничены для использования с подвижными фазами при pH 8 и выше, поэтому контроль удерживания аминов в этом диапазоне ограничен. [32]

Выбор типа буфера является важным фактором при разработке метода ОФ-ЖХ, поскольку он может повлиять на удерживание, селективность и разрешение интересующих аналитов. [26] При выборе буфера для ОФ-ВЭЖХ необходимо учитывать ряд факторов, в том числе:

Некоторые из наиболее распространенных буферов, используемых в ОФ-ВЭЖХ, включают: [34]

Заряженные аналиты можно разделить на колонке с обращенной фазой с помощью спаривания ионов (также называемого взаимодействием ионов). Этот метод известен как обращенно-фазовая ионно-парная хроматография. [35]

Элюирование можно проводить изократически (состав водно-растворителя не меняется в процессе разделения) или с использованием градиента раствора (состав водно-растворителя изменяется в процессе разделения, обычно за счет уменьшения полярности).

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ ИЮПАК , Сборник химической терминологии , 2-е изд. («Золотая книга») (1997). Исправленная онлайн-версия: (2006–) «Обращенно-фазовая хроматография». дои :10.1351/goldbook.R05376
  2. ^ Жувела, Петар; Скочилас, Магдалена; Джей Лю, Дж.; Бачек, Томаш; Калисзан, Роман; Вонг, Минг Ва; Бушевский, Богуслав; Хебергер, К. (2019). «Системы определения характеристик и выбора колонок в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии». Химические обзоры . 119 (6): 3674–3729. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00246. PMID  30604951. S2CID  58631771.
  3. ^ Дорси, Джон Г.; Дилл, Кен А. (1989). «Молекулярный механизм удерживания в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии». Химические обзоры . 89 (2): 331–346. дои : 10.1021/cr00092a005.
  4. ^ Ганеш, В.; Пурна Басури, П.; Сахини, К.; Налини, Китай (2023). «Поведение аналитов при удерживании в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии - обзор». Биомедицинская хроматография . 37 (7): e5482. дои : 10.1002/bmc.5482. ISSN  0269-3879. PMID  35962484. S2CID  251540223.
  5. ^ Папе, Питер Г. (2017). «Силилирующие агенты». Энциклопедия химической технологии Кирка-Отмера . стр. 1–15. дои : 10.1002/0471238961.1909122516011605.a01.pub3. ISBN 9780471238966.
  6. ^ Майорс, Рональд; Долан, Джон; Карр, Питер; Снайдер, Ллойд (2010). «Новые горизонты обращенно-фазовой хроматографии». LCGC Северная Америка . LCGC Северная Америка-01.06.2010. 28 (6): 418–430.
  7. ↑ abc Акул Мехта (27 декабря 2012 г.). «Принцип обращенно-фазовой хроматографии ВЭЖХ/УЭЖХ (с анимацией)». ФармаXChange . Проверено 10 января 2013 г.
  8. ^ Я Молнар и К. Хорват (сентябрь 1976 г.). «Обратно-фазовая хроматография полярных биологических веществ: разделение катехоловых соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии». Клиническая химия . 22 (9): 1497–1502. дои : 10.1093/клинчем/22.9.1497 . ПМИД  8221 . Проверено 10 января 2013 г.
  9. ^ (Клиническая биохимия, TWHrubey, 54)
  10. ^ Эванс, Дэвид Р.Х.; Ромеро, Джонатан К.; Вестоби, Мэтью (2009), «Глава 9. Концентрация белков и удаление растворенных веществ», Руководство по очистке белков, 2-е издание, Методы энзимологии, том. 463, Elsevier, стр. 97–120, номер документа : 10.1016/s0076-6879(09)63009-3, ISBN. 978-0-12-374536-1, PMID  19892169 , получено 13 октября 2022 г.
  11. ^ Жувела, Петар; Скочилас, Магдалена; Джей Лю, Дж.; Бачек, Томаш; Калисзан, Роман; Вонг, Минг Ва; Бушевский, Богуслав (2019). «Системы определения характеристик колонок и выбора в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии». Химические обзоры . 119 (6): 3674–3729. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00246. ISSN  0009-2665. PMID  30604951. S2CID  58631771.
  12. ^ Русли, Хандаджая; Путри, Риндиа М.; Ални, Анита (2022). «Последние разработки жидкостной хроматографии на неподвижных фазах для разделения соединений: от белков до небольших органических соединений». Молекулы . 27 (3): 907. doi : 10,3390/molecules27030907 . ISSN  1420-3049. ПМЦ 8840574 . ПМИД  35164170. 
  13. ^ «Преимущества силикагелей для упаковки ВЭЖХ - AGC Chemicals» . 10.11.2020 . Проверено 17 октября 2023 г.
  14. ^ Цю, Хундэн; Лян, Сяоцзин; Вс, Мин; Цзян, Шэнсян (2011). «Разработка неподвижных фаз на основе диоксида кремния для высокоэффективной жидкостной хроматографии». Аналитическая и биоаналитическая химия . 399 (10): 3307–3322. doi : 10.1007/s00216-010-4611-x. ISSN  1618-2650. PMID  21221544. S2CID  40721088.
  15. ^ Классенс, HA; ван Стратен, Массачусетс (2004). «Обзор химической и термической стабильности неподвижных фаз для обращенно-фазовой жидкостной хроматографии». Журнал хроматографии А. Стационарная фаза и хроматографическое удерживание: в честь Дж. Дж. Киркланда. 1060 (1): 23–41. doi :10.1016/j.chroma.2004.08.098. ISSN  0021-9673.
  16. ^ Жувела, Петар; Скочилас, Магдалена; Джей Лю, Дж.; Бачек, Томаш; Калисзан, Роман; Вонг, Минг Ва; Бушевский, Богуслав (2019). «Системы определения характеристик колонок и выбора в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии». Химические обзоры . 119 (6): 3674–3729. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00246. ISSN  0009-2665. PMID  30604951. S2CID  58631771.
  17. ^ Чеонг, Вон Джо (2014). «Частицы пористого кремнезема как среда хроматографического разделения: обзор». Бюллетень Корейского химического общества . 35 (12): 3465–3474. дои : 10.5012/bkcs.2014.35.12.3465 . ISSN  0253-2964.
  18. ^ «Колонка ВЭЖХ - Размеры пор и диаметры частиц» . www.crawfordscientific.com . Проверено 17 октября 2023 г.
  19. ^ «Размер пор в зависимости от размера частиц в колонках ВЭЖХ». Хром Тех, Инк . Проверено 17 октября 2023 г.
  20. ^ «Список колонок USP L - Колонки для ВЭЖХ и нерасфасованные среды» . СМТ . Проверено 17 октября 2023 г.
  21. ^ Хроматографические реагенты USP 2007-2008: Используются в USP-NF и Фармакопейном форуме . Фармакопея США. 2007.
  22. ^ Жувела, Петар; Скочилас, Магдалена; Джей Лю, Дж.; Бачек, Томаш; Калисзан, Роман; Вонг, Минг Ва; Бушевский, Богуслав (27 марта 2019 г.). «Системы определения характеристик колонок и выбора в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии». Химические обзоры . 119 (6): 3674–3729. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00246. ISSN  0009-2665. PMID  30604951. S2CID  58631771.
  23. ^ Guillarme, Davy; Ruta, Josephine; Rudaz, Serge; Veuthey, Jean-Luc (2010). "New trends in fast and high-resolution liquid chromatography: a critical comparison of existing approaches". Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3): 1069–1082. doi:10.1007/s00216-009-3305-8. ISSN 1618-2642. PMID 19998028. S2CID 21218108.
  24. ^ Fekete, Szabolcs; Olh, Erzsbet; Fekete, Jen (2012). "Fast liquid chromatography: The domination of core?shell and very fine particles". Journal of Chromatography A. 1228: 57–71. doi:10.1016/j.chroma.2011.09.050. PMID 21982449.
  25. ^ Fekete, Szabolcs; Ganzler, Katalin; Fekete, Jenő (2011). "Efficiency of the new sub-2μm core–shell (Kinetex™) column in practice, applied for small and large molecule separation". Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 54 (3): 482–490. doi:10.1016/j.jpba.2010.09.021. PMID 20940092.
  26. ^ a b Boyes, Barry; Dong, Michael (2018). "Modern Trends and Best Practices in Mobile-Phase Selection in Reversed-Phase Chromatography". LCGC North America. LCGC North America-10-01-2018. 36 (10): 752–768.
  27. ^ Boyes, Barry; Dong, Michael (2018). "Modern Trends and Best Practices in Mobile-Phase Selection in Reversed-Phase Chromatography". LCGC North America. LCGC North America-10-01-2018. 36 (10): 752–768.
  28. ^ Heyrman, Aimee N.; Henry, Richard A. (1999). "Importance of Controlling Mobile Phase pH in Reversed Phase HPLC". Keystone Technical Bulletin.
  29. ^ Schoenmakers, Peter J.; van Molle, Sylvie; Hayes, Carmel M. G.; Uunk, Louis G. M. (1991). "Effects of pH in reversed-phase liquid chromatography". Analytica Chimica Acta. 250: 1–19. Bibcode:1991AcAC..250....1S. doi:10.1016/0003-2670(91)85058-Z. ISSN 0003-2670.
  30. ^ Dolan, John (2017-01-01). "Back to Basics: The Role of pH in Retention and Selectivity". LCGC North America. LCGC North America-01-01-2017. 35 (1): 22–28.
  31. ^ "How does an acid pH affect reversed-phase chromatography separations?". www.biotage.com. Retrieved 2023-10-18.
  32. ^ Kirkland, J. J.; van Straten, M. A.; Claessens, H. A. (1995). "High pH mobile phase effects on silica-based reversed-phase high-performance liquid chromatographic columns". Journal of Chromatography A. 18th International Symposium On Column Liquid Chromatography Part I. 691 (1): 3–19. doi:10.1016/0021-9673(94)00631-I. ISSN 0021-9673. S2CID 53646741.
  33. ^ Dolan, John. "A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection" (PDF).
  34. ^ V. Agrahari; M. Bajpai; S. Nanda (2013). "Essential Concepts of Mobile Phase Selection for Reversed Phase HPLC". Research J. Pharm. And Tech. 6 (5): 459–464.
  35. ^ Gilar, Martin; Fountain, Kenneth J.; Budman, Yeva; Neue, Uwe D.; Yardley, Kurt R.; Rainville, Paul D.; Russell II, Reb J.; Gebler, John C. (2002). "Ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography analysis of oligonucleotides:: Retention prediction". Journal of Chromatography A. 958 (1): 167–182. doi:10.1016/S0021-9673(02)00306-0. ISSN 0021-9673. PMID 12134814.

External links