stringtranslate.com

TaqMan

Зонды TaqMan — это гидролизные зонды , предназначенные для повышения специфичности количественной ПЦР . Метод был впервые описан в 1991 году исследователем Кэри Маллисом из Cetus Corporation [1] , а впоследствии технология была разработана компанией Hoffmann-La Roche для диагностических анализов и компанией Applied Biosystems (теперь часть Thermo Fisher Scientific ) для исследовательских целей.

Принцип зонда TaqMan основан на 5´–3´ экзонуклеазной активности полимеразы Taq для расщепления зонда с двойной меткой во время гибридизации с комплементарной целевой последовательностью и детекции на основе флуорофора . [2] Как и в других количественных методах ПЦР, полученный сигнал флуоресценции позволяет проводить количественные измерения накопления продукта во время экспоненциальных стадий ПЦР; однако зонд TaqMan значительно увеличивает специфичность детекции. Зонды TaqMan были названы в честь видеоигры Pac-Man ( Taq Polymerase + PacMan = TaqMan), поскольку ее механизм основан на принципе Pac-Man. [3]

Принцип

Механизм химии зонда TaqMan

Зонды TaqMan состоят из флуорофора, ковалентно присоединенного к 5'-концу олигонуклеотидного зонда , и гасителя на 3'-конце. [4] Доступно несколько различных флуорофоров (например, 6-карбоксифлуоресцеин , акроним: FAM , или тетрахлорфлуоресцеин, акроним: TET) и гасителей (например, тетраметилродамин , акроним: TAMRA). [5] Молекула гасителя гасит флуоресценцию, испускаемую флуорофором при возбуждении источником света циклера посредством резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET). [6] Пока флуорофор и гаситель находятся в непосредственной близости, гашение подавляет любые сигналы флуоресценции.

Зонды TaqMan разработаны таким образом, что они отжигаются в области ДНК, амплифицированной определенным набором праймеров. (В отличие от схемы, зонд связывается с одноцепочечной ДНК.) Зонды TaqMan могут быть конъюгированы с фрагментом связывателя малой бороздки (MGB), трипептидом дигидроциклопирролоиндола (DPI 3 ), чтобы увеличить его связывающую способность с целевой последовательностью; зонды, конъюгированные с MGB, имеют более высокую температуру плавления (T m ) из-за повышенной стабилизации сил Ван-дер-Ваальса. Поскольку полимераза Taq удлиняет праймер и синтезирует зарождающуюся цепь (из одноцепочечной матрицы), 5'-3' экзонуклеазная активность полимеразы Taq разрушает зонд, отожженный с матрицей. Деградация зонда высвобождает флуорофор из него и нарушает близость к гасителю, тем самым снимая эффект гашения и допуская флуоресценцию флуорофора. Таким образом, флуоресценция, обнаруженная в термоциклере количественной ПЦР , прямо пропорциональна высвобожденному флуорофору и количеству ДНК-матрицы, присутствующей в ПЦР.

Приложения

Анализы на основе зондов TaqMan широко используются в количественной ПЦР в исследовательских и медицинских лабораториях :

Смотрите также

Примечания и ссылки

  1. ^ Холланд, П. М.; Абрамсон, Р. Д.; Уотсон, Р.; Гельфанд, Д. Х. (1991). «Обнаружение специфического продукта полимеразной цепной реакции с использованием 5'----3' экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Thermus aquaticus». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 88 (16): 7276–7280. Bibcode : 1991PNAS ...88.7276H. doi : 10.1073/pnas.88.16.7276 . PMC  52277. PMID  1871133.
  2. ^ Экспрессия гена TaqMan - Проекты NCBI
  3. ^ TaqMan PCR в реальном времени и его применение в ветеринарии - От PacMan до TaqMan - компьютерная игра, переосмысленная Архивировано 05.05.2009 на Wayback Machine
  4. ^ TaqMan Probes: Введение, функционирование и применение
  5. ^ Кутявин IV, Афонина IA, Миллс A, Горн VV, Лухтанов EA, Белоусов ES, Сингер MJ, Уолбургер DK, Лохов SG, Галл AA, Демпси R, Рид MW, Мейер RB, Хеджпет J (2000). "3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specibility at PCR extensiontemperatures". Nucleic Acids Res . 28 (2): 655–661. doi :10.1093/nar/28.2.655. PMC 102528. PMID  10606668 . 
  6. ^ Bustin SA (октябрь 2000 г.). «Абсолютная количественная оценка мРНК с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени». J. Mol. Endocrinol . 25 (2): 169–93. doi : 10.1677/jme.0.0250169 . PMID  11013345.
  7. ^ AlleleID — Разработка анализа для идентификации бактерий

Внешние ссылки

1. Ресурсы TaqMan RT-PCR — базы данных праймеров, программное обеспечение, протоколы. Архивировано 25 ноября 2010 г. на Wayback Machine.
2. Beacon Designer — программное обеспечение для разработки праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени, включая праймеры SYBR Green, зонды TaqMan, молекулярные маяки.