Очистка белка представляет собой ряд процессов, предназначенных для выделения одного или нескольких белков из сложной смеси, обычно клеток , тканей или целых организмов. Очистка белка имеет жизненно важное значение для спецификации функции, структуры и взаимодействий интересующего белка. Процесс очистки может разделять белковые и небелковые части смеси и, наконец, отделять желаемый белок от всех других белков. В идеале, чтобы изучить интересующий белок, его необходимо отделить от других компонентов клетки, чтобы загрязняющие вещества не мешали изучению структуры и функции интересующего белка. [1] Отделение одного белка от всех других, как правило, является наиболее трудоемким аспектом очистки белка. Этапы разделения обычно используют различия в размере белка, физико-химических свойствах, связывающей аффинности и биологической активности . Чистый результат можно назвать белковым изолятом .
Стоимость производства белка остается высокой, и растет спрос на разработку экономически эффективных и быстрых методов очистки белка. Понимание различных методов очистки белка и оптимизация последующей обработки имеют решающее значение для минимизации производственных затрат при сохранении качества приемлемых стандартов однородности. [2] Очистка белка бывает либо препаративной , либо аналитической . Препаративная очистка направлена на получение относительно большого количества очищенных белков для последующего использования. Примерами являются получение коммерческих продуктов, таких как ферменты (например, лактаза ), пищевые белки (например, изолят соевого белка ) и некоторые биофармацевтические препараты (например, инсулин ). Несколько этапов препаративной очистки часто используются для удаления побочных продуктов, таких как белки клетки-хозяина , которые представляют потенциальную угрозу здоровью пациента. [3] Аналитическая очистка производит относительно небольшое количество белка для различных исследовательских или аналитических целей, включая идентификацию, количественную оценку и изучение структуры белка , посттрансляционных модификаций и функций. Каждый шаг схемы очистки белка контролируется и учитывает уровни очистки и выход. Высокий уровень очистки и плохой выход едва ли оставляют белок, с которым можно экспериментировать. С другой стороны, высокий выход с низким уровнем очистки оставляет много загрязняющих веществ (белков, отличных от интересующих), которые мешают исследовательским целям. [1]
Если интересующий белок не секретируется организмом в окружающий раствор, первым шагом каждого процесса очистки является разрушение клеток, содержащих белок. В зависимости от того, насколько хрупок белок и насколько стабильны клетки, можно, например, использовать один из следующих методов: i) повторное замораживание и оттаивание, ii) обработка ультразвуком , iii) гомогенизация под высоким давлением ( френч-пресс ), iv) гомогенизация путем измельчения (бисерная мельница) и v) пермеабилизация детергентами (например, Triton X-100 ) и/или ферментами (например, лизоцимом ). [4] Наконец, клеточный дебрис можно удалить с помощью дифференциального центрифугирования, которое представляет собой процедуру, при которой гомогенат центрифугируется на низкой скорости, а затем снова с большей силой, чтобы получить осадок, состоящий из ядер и супернатанта. Это дает несколько фракций с уменьшающейся плотностью, где к одной фракции применяются более дискриминационные методы очистки. [1]
Также протеазы высвобождаются во время лизиса клеток , что начнет переваривать белки в растворе. Если интересующий белок чувствителен к протеолизу , рекомендуется действовать быстро и держать экстракт охлажденным, чтобы замедлить переваривание. В качестве альтернативы можно добавить один или несколько ингибиторов протеазы в буфер лизиса непосредственно перед разрушением клеток. Иногда также необходимо добавить ДНКазу , чтобы снизить вязкость клеточного лизата, вызванную высоким содержанием ДНК .
Центрифугирование — это процесс, который использует центробежную силу для разделения смесей частиц различной массы или плотности, взвешенных в жидкости. Когда сосуд (обычно пробирка или бутылка), содержащий смесь белков или других твердых частиц, таких как бактериальные клетки, вращается с высокой скоростью, инерция каждой частицы создает силу в направлении скорости частицы, пропорциональную ее массе. Тенденция данной частицы двигаться через жидкость из-за этой силы компенсируется сопротивлением, которое жидкость оказывает частице. Чистый эффект «вращения» образца в центрифуге заключается в том, что массивные, мелкие и плотные частицы движутся наружу быстрее, чем менее массивные частицы или частицы с большим «сопротивлением» в жидкости. Когда суспензии частиц «вращаются» в центрифуге, на дне сосуда может образоваться «осадок», который обогащен наиболее массивными частицами с низким сопротивлением в жидкости.
Неуплотненные частицы остаются в основном в жидкости, называемой «супернатант», и могут быть удалены из сосуда, тем самым отделяя супернатант от осадка. Скорость центрифугирования определяется угловым ускорением, приложенным к образцу, обычно измеряемым по сравнению с g . Если образцы центрифугируются достаточно долго, частицы в сосуде достигнут равновесия, при котором частицы будут накапливаться именно в той точке сосуда, где их плавучая плотность уравновешивается центробежной силой. Такое «равновесное» центрифугирование может обеспечить обширную очистку данной частицы.
Центрифугирование в градиенте сахарозы — линейный градиент концентрации сахара (обычно сахарозы, глицерина или градиентной среды на основе кремния, например, Percoll ) — создается в пробирке таким образом, что самая высокая концентрация находится внизу, а самая низкая — вверху. Percoll — торговая марка, принадлежащая компаниям GE Healthcare. Затем образец белка наслаивается поверх градиента и вращается на высоких скоростях в ультрацентрифуге . Это заставляет тяжелые макромолекулы мигрировать ко дну пробирки быстрее, чем более легкий материал. Во время центрифугирования в отсутствие сахарозы, поскольку частицы движутся все дальше и дальше от центра вращения, они испытывают все большую центробежную силу (чем дальше они движутся, тем быстрее они движутся). Проблема в том, что полезный диапазон разделения внутри сосуда ограничен небольшим наблюдаемым окном. Вращение образца в два раза дольше не означает, что интересующая частица пройдет в два раза большее расстояние; на самом деле, она пройдет значительно большее расстояние. Однако, когда белки движутся через градиент сахарозы, они сталкиваются с жидкостью с увеличивающейся плотностью и вязкостью. Правильно разработанный градиент сахарозы будет противодействовать увеличивающейся центробежной силе, поэтому частицы будут двигаться в близкой пропорции ко времени, которое они провели в центробежном поле. Образцы, разделенные этими градиентами, называются центрифугированием «скоростной зоны». После разделения белка/частиц градиент затем фракционируется и собирается. В биохимии ультрацентрифугирование ценно для разделения биомолекул и анализа их физических свойств. [1]
Выбор исходного материала является ключом к разработке процесса очистки. В растении или животном определенный белок обычно не распределен однородно по всему телу; разные органы или ткани имеют более высокую или более низкую концентрацию белка. Использование только тканей или органов с самой высокой концентрацией уменьшает объемы, необходимые для производства заданного количества очищенного белка. Если белок присутствует в небольшом количестве или если он имеет высокую ценность, ученые могут использовать технологию рекомбинантной ДНК для разработки клеток, которые будут производить большие количества желаемого белка (это известно как система экспрессии ). Рекомбинантная экспрессия позволяет пометить белок, например, His-меткой [5] или Strep-меткой [6], чтобы облегчить очистку, сокращая количество требуемых этапов очистки.
Аналитическая очистка обычно использует три свойства для разделения белков. Во-первых, белки могут быть очищены в соответствии с их изоэлектрическими точками, пропуская их через гель с градиентом pH или ионообменную колонку. Во-вторых, белки могут быть разделены в соответствии с их размером или молекулярной массой с помощью гель-фильтрации или с помощью анализа SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Белки часто очищают с помощью 2D-PAGE , а затем анализируют с помощью пептидного массового отпечатка для установления идентичности белка. Это очень полезно для научных целей, и пределы обнаружения белка в настоящее время очень низкие, и для их анализа достаточно нанограммовых количеств белка. В-третьих, белки могут быть разделены по полярности/гидрофобности с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или обращенно-фазовой хроматографии .
Обычно протокол очистки белка содержит один или несколько хроматографических этапов. Основная процедура в хроматографии заключается в том, чтобы пропустить раствор, содержащий белок, через колонку, заполненную различными материалами. Различные белки по-разному взаимодействуют с материалом колонки и, таким образом, могут быть разделены по времени, необходимому для прохождения колонки, или по условиям, необходимым для элюирования белка из колонки. Обычно белки обнаруживаются по мере их выхода из колонки по их поглощению при 280 нм. Существует множество различных хроматографических методов:
Большинству белков требуется некоторое количество соли для растворения в воде, процесс, называемый засаливанием. По мере увеличения концентрации соли белки могут выпадать в осадок, процесс, называемый высаливанием, который включает изменение растворимости белка. [1] Например, при массовой очистке белка обычным первым шагом для выделения белков является осаждение сульфатом аммония (NH 4 ) 2 SO 4 . [7] Это выполняется путем добавления увеличивающегося количества сульфата аммония и сбора различных фракций осажденного белка. Впоследствии сульфат аммония можно удалить с помощью диализа (отделение белков от небольших молекул через полупроницаемую мембрану). [1] На этапе осаждения сульфатом аммония гидрофобные группы, присутствующие в белках, подвергаются воздействию атмосферы, притягивая другие гидрофобные группы; результатом является образование агрегата гидрофобных компонентов. В этом случае осадок белка, как правило, будет виден невооруженным глазом . Одним из преимуществ этого метода является то, что его можно выполнять недорого, даже с очень большими объемами.
Первыми очищаемыми белками являются водорастворимые белки. Очистка интегральных мембранных белков требует разрушения клеточной мембраны для того, чтобы изолировать какой-либо один конкретный белок от других, которые находятся в том же мембранном отсеке. Иногда сначала можно выделить определенную мембранную фракцию, например, изолируя митохондрии от клеток перед очисткой белка, находящегося в митохондриальной мембране. Для растворения клеточных мембран и поддержания мембранных белков в растворе во время очистки можно использовать детергент, такой как додецилсульфат натрия (SDS); однако, поскольку SDS вызывает денатурацию , можно использовать более мягкие детергенты, такие как Triton X-100 или CHAPS, чтобы сохранить нативную конформацию белка во время полной очистки.
Хроматографию можно использовать для разделения белков в растворе или денатурирующих условиях с использованием пористых гелей. Этот метод является более дискриминационным разделением и известен как эксклюзионная хроматография . Принцип заключается в том, что более мелкие молекулы должны пройти через больший объем в пористой матрице. Следовательно, белки определенного диапазона размеров потребуют переменного объема элюента (растворителя) перед тем, как будут собраны на другом конце колонки геля. Более крупные молекулы (или белки) пройдут через меньший объем и элюируются раньше, чем более мелкие молекулы.
В контексте очистки белка элюент обычно объединяют в разных пробирках. Все пробирки, не содержащие измеримых следов очищаемого белка, отбрасываются. Таким образом, оставшийся раствор состоит из очищаемого белка и любых других белков схожего размера.
Одной хроматографической техники, основанной на молекулярных свойствах, обычно недостаточно для получения белка высокой чистоты. [1] Помимо размера, ионообменная хроматография разделяет соединения в соответствии с природой и степенью их ионного заряда. Используемая колонка выбирается в соответствии с ее типом и силой заряда. Анионообменные смолы имеют положительный заряд и используются для удержания и разделения отрицательно заряженных соединений (анионов), в то время как катионообменные смолы имеют отрицательный заряд и используются для разделения положительно заряженных молекул (катионов).
Перед началом разделения через колонку прокачивается буфер для уравновешивания противоположно заряженных ионов. После введения образца молекулы растворенного вещества будут обмениваться с ионами буфера, поскольку каждый из них конкурирует за места связывания на смоле. Продолжительность удерживания каждого растворенного вещества зависит от силы его заряда. Сначала будут элюироваться наиболее слабо заряженные соединения, а затем те, у которых заряды последовательно сильнее. Из-за природы механизма разделения pH, тип буфера, концентрация буфера и температура играют важную роль в контроле разделения.
Ионообменная хроматография является очень мощным инструментом для очистки белков и часто применяется как в аналитическом, так и в препаративном разделении.
Электрофорез свободного потока (FFE) — это метод электрофореза без носителя, который позволяет проводить препаративное разделение белков в ламинарном потоке буфера с использованием ортогонального электрического поля. Используя градиент pH, который может быть вызван, например, амфолитами , этот метод позволяет разделять изоформы белков до разрешения < 0,02 дельта-pI.
Среда HIC является амфифильной, с гидрофобными и гидрофильными областями, что позволяет разделять белки на основе их поверхностной гидрофобности. Целевые белки и их агрегатные виды продуктов, как правило, имеют различные гидрофобные свойства, и их удаление с помощью HIC дополнительно очищает интересующий белок. [8] Кроме того, используемая среда обычно использует менее жесткие условия денатурации, чем другие методы хроматографии, что помогает сохранить интересующий белок в его нативном и функциональном состоянии. В чистой воде взаимодействие между смолой и гидрофобными областями белка будет очень слабым, но это взаимодействие усиливается путем нанесения образца белка на смолу HIC в буфере с высокой ионной силой. Затем ионная сила буфера снижается для элюирования белков в порядке уменьшения гидрофобности. [9]
Аффинная хроматография — еще один мощный метод разделения, который является высокоселективным для интересующего белка на основе молекулярной конформации, который часто использует смолы, специфичные для конкретного применения. Эти смолы имеют лиганды, прикрепленные к их поверхностям, которые являются специфическими для разделяемых соединений. Чаще всего эти лиганды функционируют аналогично взаимодействиям антитело-антиген. Такое соответствие «замка и ключа» между лигандом и его целевым соединением делает его высокоспецифичным, часто генерируя один пик, в то время как все остальное в образце не удерживается.
Многие мембранные белки являются гликопротеинами и могут быть очищены с помощью лектиновой аффинной хроматографии. Детергент-солюбилизированным белкам можно позволить связываться с хроматографической смолой, которая была модифицирована для ковалентно прикрепленного лектина. Белки, которые не связываются с лектином, смываются, а затем специфически связанные гликопротеины могут быть элюированы путем добавления высокой концентрации сахара, который конкурирует со связанными гликопротеинами в месте связывания лектина. Некоторые лектины имеют высокое сродство связывания с олигосахаридами гликопротеинов, с которым трудно конкурировать с сахарами, и связанные гликопротеины необходимо высвобождать путем денатурации лектина.
Иммуноаффинная хроматография использует специфическое связывание антитела с антигеном для селективной очистки целевого белка. Процедура включает иммобилизацию белка на твердом субстрате (например, пористом шарике или мембране), который затем селективно связывает цель, в то время как все остальное протекает через него. Целевой белок можно элюировать, изменяя pH или соленость . Иммобилизованный лиганд может быть антителом (например, иммуноглобулином G ) или белком (например, белком A ). Поскольку этот метод не включает в себя инженерию в метке, его можно использовать для белков из природных источников. [10]
Высокоэффективная жидкостная хроматография или жидкостная хроматография высокого давления — это форма хроматографии, использующая высокое давление для более быстрого прохождения растворенных веществ через колонку. Это означает, что диффузия ограничена, а разрешение улучшено. Наиболее распространенной формой является «обращенно-фазовая» ВЭЖХ, где материал колонки гидрофобен . Белки элюируются градиентом возрастающих количеств органического растворителя , такого как ацетонитрил. Белки элюируются в соответствии с их гидрофобностью. После очистки с помощью ВЭЖХ белок находится в растворе, который содержит только летучие соединения, и его можно легко лиофилизировать. [11] Очистка с помощью ВЭЖХ часто приводит к денатурации очищенных белков и, таким образом, неприменима к белкам, которые не спонтанно рефолдируются.
Другой способ маркировки белков — это создание антигенной пептидной метки на белке, а затем очистка белка на колонке или путем инкубации с рыхлой смолой, покрытой иммобилизованным антителом . Эта конкретная процедура известна как иммунопреципитация . Иммунопреципитация способна генерировать чрезвычайно специфическое взаимодействие, которое обычно приводит к связыванию только желаемого белка. Очищенные маркированные белки затем можно легко отделить от других белков в растворе и позже элюировать обратно в чистый раствор.
Когда теги больше не нужны, их можно отщепить протеазой. Это часто подразумевает создание сайта расщепления протеазой между тегом и белком.
Обратите внимание, что саморасщепляющаяся метка устраняет необходимость использования протеаз для отделения метки от целевого белка в процессе очистки ( например , CapTag™). [12] [13] Основным компонентом метки является интеин, который отщепляется просто после изменения pH. Затем не содержащий метки и чистый целевой белок высвобождается в буфер элюирования.
В конце очистки белка часто приходится концентрировать белок. Существуют разные методы.
Если раствор не содержит никаких других растворимых компонентов, кроме белка, о котором идет речь, белок можно лиофилизировать (высушить). Обычно это делается после ВЭЖХ. Это просто удаляет все летучие компоненты, оставляя белки.
Ультрафильтрация концентрирует белковый раствор с помощью селективных проницаемых мембран. Функция мембраны — пропускать воду и небольшие молекулы, удерживая белок. Раствор нагнетается на мембрану механическим насосом, давлением газа или центрифугированием.
Наиболее общим методом мониторинга процесса очистки является проведение SDS-PAGE различных этапов. Этот метод дает только грубую оценку количества различных белков в смеси и не позволяет различать белки с похожей кажущейся молекулярной массой .
Если белок имеет отличительную спектроскопическую особенность или ферментативную активность , это свойство может быть использовано для обнаружения и количественной оценки конкретного белка, и, таким образом, для выбора фракций разделения, которые содержат белок. Если антитела против белка доступны, то вестерн-блот и ИФА могут специфически обнаружить и количественно определить количество желаемого белка. Некоторые белки функционируют как рецепторы и могут быть обнаружены на этапах очистки с помощью анализа связывания лиганда , часто с использованием радиоактивного лиганда .
Для оценки процесса многоступенчатой очистки количество конкретного белка необходимо сравнить с количеством общего белка. Последнее можно определить с помощью анализа общего белка по Брэдфорду или по поглощению света при 280 нм , однако некоторые реагенты, используемые в процессе очистки, могут мешать количественному определению. Например, имидазол (обычно используемый для очистки рекомбинантных белков с полигистидиновыми метками) является аналогом аминокислоты и при низких концентрациях будет мешать анализу бицинхониновой кислоты (БЦК) для количественного определения общего белка. Примеси в имидазоле низкого качества также будут поглощать при 280 нм, что приведет к неточному считыванию концентрации белка из УФ-поглощения.
Другой метод, который следует рассмотреть, — это поверхностный плазмонный резонанс (SPR). SPR может обнаружить связывание свободных от меток молекул на поверхности чипа. Если желаемый белок — антитело, связывание может быть напрямую переведено в активность белка. Можно выразить активную концентрацию белка как процент от общего белка. SPR может быть мощным методом для быстрого определения активности белка и общего выхода. Это мощная технология, для работы которой требуется инструмент.
Электрофорез в геле — это распространенная лабораторная техника, которая может использоваться как в качестве препаративного, так и аналитического метода. Принцип электрофореза основан на движении заряженного иона в электрическом поле. На практике белки денатурируют в растворе, содержащем детергент ( SDS ). В этих условиях белки разворачиваются и покрываются отрицательно заряженными молекулами детергента. Белки в SDS-PAGE разделяются исключительно на основе их размера.
В аналитических методах белок мигрирует в виде полос в зависимости от размера. Каждую полосу можно обнаружить с помощью окрашивания, например, красителем Кумасси синим или серебряным красителем . Препаративные методы очистки больших количеств белка требуют извлечения белка из электрофоретического геля. Это извлечение может включать вырезание геля, содержащего полосу, или элюирование полосы непосредственно из геля, когда она стекает с конца геля.
В контексте стратегии очистки электрофорез в денатурирующих условиях обеспечивает улучшенное разрешение по сравнению с эксклюзионной хроматографией, но не масштабируется для больших количеств белков в образце, а также для колонок поздней хроматографии .
Неденатурирующая электрофоретическая процедура для выделения биоактивных металлопротеинов в сложных белковых смесях — это препаративный нативный ПААГ . Целостность или структурная целостность выделенного белка должна быть подтверждена независимым методом. [14]