В микробиологии термин «изоляция» относится к выделению штамма из естественной, смешанной популяции живых микробов , присутствующих в окружающей среде, например, в воде или почве , или из живых существ с флорой кожи , полости рта или кишечника , с целью идентификации интересующего микроба(ов). [1] Исторически лабораторные методы изоляции впервые были разработаны в области бактериологии и паразитологии (в 19 веке), а затем в вирусологии в 20 веке.
Лабораторные методы выделения микробов впервые были разработаны в 19 веке в области бактериологии и паразитологии с использованием световой микроскопии . 1860 год ознаменовался успешным введением жидкой среды Луи Пастером . Жидкая культура, разработанная Пастером, позволила визуализировать стимулирование или подавление роста определенных бактерий. Этот же метод используется сегодня с помощью различных сред, таких как маннит-солевой агар , твердая среда. Твердые культуры были разработаны в 1881 году, когда Роберт Кох затвердел в жидкой среде путем добавления агара [2]
Правильные методы изоляции вирусологии не существовали до 20-го века. Методы микробной изоляции радикально изменились за последние 50 лет, как с точки зрения труда с ростом механизации, так и с точки зрения задействованных технологий, а вместе с ними скорости и точности.
Чтобы выделить микроб из естественной, смешанной популяции живых микробов , присутствующих в окружающей среде, например, в водной или почвенной флоре , или из живых существ с кожной , ротовой или кишечной флорой , необходимо отделить его от смеси.
Традиционно микробы культивировались для идентификации интересующего микроба(ов) на основе характеристик его роста. В зависимости от ожидаемой плотности и жизнеспособности микробов, присутствующих в образце жидкости, могут быть выбраны физические методы увеличения градиента, например, серийное разбавление или центрифугирование . Для выделения организмов в материалах с высоким содержанием микробов, таких как сточные воды, почва или стул, серийные разбавления увеличат вероятность разделения смеси.
В жидкой среде с небольшим количеством или без ожидаемых организмов, из области, которая обычно стерильна (например, цереброспинальная жидкость , кровь внутри кровеносной системы), центрифугирование, декантация супернатанта и использование только осадка увеличит вероятность выращивания и выделения бактерий или обычно связанных с клетками вирусов.
Если ожидается или ищется особенно привередливый организм, микробиологические методы культивирования и изоляции должны быть ориентированы на этот микроб. Например, бактерия, которая погибает при контакте с воздухом, может быть выделена только в том случае, если образец перевозится и обрабатывается в безвоздушных или анаэробных условиях. Бактерия, которая погибает при контакте с комнатной температурой (термофильная), требует предварительно нагретого транспортного контейнера, а микроб, который высыхает и погибает при переносе на ватном тампоне, нуждается в вирусной транспортной среде, прежде чем его можно будет успешно культивировать.
Лаборанты инокулируют образец на определенные твердые агаровые пластины методом штрихового посева или в жидкую питательную среду , в зависимости от цели изоляции:
После инокуляции образца в выбранную среду или на нее его инкубируют в соответствующих атмосферных условиях, таких как аэробные, анаэробные или микроаэрофильные условия, или с добавлением углекислого газа (5%), при различных температурных настройках, например, при 37 °C в инкубаторе или в холодильнике для холодового обогащения, при соответствующем освещении, например, строго без света, завернутым в бумагу или в темной бутылке для скотохромогенных микобактерий, и в течение различного периода времени, поскольку разные бактерии растут с разной скоростью, варьирующейся от часов ( Escherichia coli ) до недель (например, микобактерии ).
Лаборанты и микробиологи регулярно и последовательно проверяют среду на наличие признаков видимого роста и регистрируют их. Проверка снова должна проводиться в условиях, благоприятствующих выживанию изолята, например, в «анаэробной камере» для анаэробных бактерий, и в условиях, которые не угрожают человеку, смотрящему на чашки, заражением особо инфекционным микробом, например, в биологическом боксе для Yersinia pestis (чумы) или Bacillus anthracis (сибирской язвы).
Когда бактерии заметно выросли, они часто все еще смешаны. Идентификация микроба зависит от изоляции индивидуальной колонии , так как биохимическое тестирование микроба для определения его различных физиологических особенностей зависит от чистой культуры . Чтобы сделать субкультуру , снова работают в асептической технике микробиологии , поднимая одну колонию с поверхности агара петлей и нанося материал штрихами в 4 квадранта агаровой пластины или по всей поверхности, если колония была одиночной и не выглядела смешанной.
Окрашивание по Граму позволяет визуализировать состав клеточной стенки бактерий на основе цвета, который окрашивает бактерия после серии этапов окрашивания и обесцвечивания. [4] Этот процесс окрашивания позволяет идентифицировать грамотрицательные и грамположительные бактерии. Грамотрицательные бактерии окрашиваются в розовый цвет из-за тонкого слоя пептидогликана. Если бактерия окрашивается в фиолетовый цвет из-за толстого слоя пептидогликана, то это грамположительная бактерия. [4]
В клинической микробиологии используются многочисленные другие методы окрашивания для конкретных организмов (кислотоустойчивое бактериальное окрашивание для микобактерий). Иммунологические методы окрашивания, такие как прямая иммунофлуоресценция , были разработаны для медицински важных патогенов , которые растут медленно ( окрашивание аурамином-родамином для микобактерий ) или трудно растут (например, виды Legionella pneumophila ) и где результат теста может изменить стандартное управление и эмпирическую терапию .
Биохимическое тестирование бактерий включает набор агаров во флаконах для разделения подвижных и неподвижных бактерий . В 1970 году была разработана миниатюрная версия, названная аналитическим индексом профиля .
Успешная идентификация, например, с помощью секвенирования генома и геномики, зависит от чистых культур.
Хотя наиболее быстрым методом идентификации бактерий является секвенирование их гена 16S рРНК , который был предварительно амплифицирован с помощью ПЦР, этот метод не требует изоляции. Поскольку большинство бактерий невозможно выращивать обычными методами (особенно бактерии окружающей среды или почвы), используются метагеномика или метатранскриптомика , дробовое секвенирование или направленное ПЦР- секвенирование генома . Секвенирование с масс-спектрометрией , как в MALDI-TOF MS, используется при анализе клинических образцов для поиска патогенов. Полное секвенирование генома является вариантом для единичного организма, который не может быть достаточно охарактеризован для идентификации. Небольшие ДНК-микрочипы также могут использоваться для идентификации.