Иммуноферментный анализ ( ИА ) — это биохимический тест, который измеряет наличие или концентрацию макромолекулы или малой молекулы в растворе с помощью антитела (обычно) или антигена (иногда). Молекула, обнаруженная с помощью иммуноферментного анализа, часто называется «аналитом » и во многих случаях является белком , хотя это могут быть и другие виды молекул, разных размеров и типов, при условии, что разработаны соответствующие антитела, обладающие требуемыми свойствами для анализа. Аналиты в биологических жидкостях, таких как сыворотка или моча, часто измеряются с помощью иммуноферментного анализа в медицинских и исследовательских целях. [1]
Иммуноанализы бывают разных форматов и вариаций. Иммуноанализы могут проводиться в несколько этапов с добавлением и вымыванием реагентов или разделением их на разных этапах анализа. Многоэтапные анализы часто называют иммуноанализами с разделением или гетерогенными иммуноанализами. Некоторые иммуноанализы можно проводить просто путем смешивания реагентов и образцов и проведения физического измерения. Такие анализы называются гомогенными иммуноанализами или реже неразделяющими иммуноанализами.
Использование калибратора часто применяется в иммуноанализах. Калибраторы — это растворы, которые, как известно, содержат исследуемое аналит, и концентрация этого аналита, как правило, известна. Сравнение ответа анализа на реальный образец с ответом анализа, полученным с помощью калибраторов, позволяет интерпретировать силу сигнала с точки зрения наличия или концентрации аналита в образце.
Иммуноферментный анализ основан на способности антитела распознавать и связывать определенную макромолекулу в том, что может быть сложной смесью макромолекул. В иммунологии конкретная макромолекула, связанная антителом, называется антигеном , а область на антигене, с которой связывается антитело, называется эпитопом .
В некоторых случаях иммуноанализ может использовать антиген для обнаружения наличия антител, которые распознают этот антиген в растворе. Другими словами, в некоторых иммуноанализах аналит может быть антителом, а не антигеном.
Помимо связывания антитела с антигеном, другой ключевой особенностью всех иммуноанализов является способ получения измеримого сигнала в ответ на связывание. Большинство, хотя и не все, иммуноанализы включают химическое связывание антител или антигенов с какой-либо обнаруживаемой меткой. В современных иммуноанализах существует большое количество меток, и они позволяют проводить обнаружение различными способами. Многие метки обнаруживаются, потому что они либо испускают излучение, либо вызывают изменение цвета в растворе, либо флуоресцируют под действием света, либо их можно заставить испускать свет.
Розалин Сассман Ялоу и Соломон Берсон считаются создателями первых иммуноанализов в 1950-х годах. Ялоу получила Нобелевскую премию за свою работу в области иммуноанализов в 1977 году, став второй американкой, получившей эту награду. [2]
Иммуноферментный анализ стал значительно проще в проведении и более популярным, когда в конце 1960-х годов были продемонстрированы методы химического связывания ферментов с антителами. [3]
В 1983 году профессор Энтони Кэмпбелл [4] из Кардиффского университета заменил радиоактивный йод, используемый в иммуноанализе, на эфир акридиния, который производит свой собственный свет: хемилюминесценцию . Этот тип иммуноанализа в настоящее время используется примерно в 100 миллионах клинических тестов каждый год по всему миру, что позволяет врачам измерять широкий спектр белков, патогенов и других молекул в образцах крови. [5]
К 2012 году прибыль коммерческой индустрии иммуноанализа составила 17 000 000 000 долларов США , и предполагалось, что она будет медленно расти в течение года в диапазоне от 2 до 3 процентов. [6]
Иммуноферментный анализ использует множество различных меток для обнаружения антител и антигенов. Метки обычно химически связаны или конъюгированы с желаемым антителом или антигеном.
Возможно, одной из самых популярных меток для использования в иммуноанализах являются ферменты . Иммуноферментные анализы, в которых используются ферменты, называются иммуноферментными анализами (ИФА), из которых наиболее распространенными являются иммуноферментный анализ (ИФА) и метод иммуноферментного анализа с множественным добавлением ферментов (ИМФ).
Ферменты, используемые в ИФА, включают пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу (AP) или глюкозооксидазу . Эти ферменты часто позволяют проводить обнаружение, поскольку они производят заметное изменение цвета в присутствии определенных реагентов. В некоторых случаях эти ферменты подвергаются воздействию реагентов, которые заставляют их производить свет или хемилюминесценцию. Существует несколько типов ИФА: прямой, непрямой, сэндвич, конкурентный. [7]
Радиоактивные изотопы могут быть включены в реагенты иммуноанализа для проведения радиоиммуноанализа (РИА). Радиоактивность, испускаемая связанными комплексами антитело-антиген, может быть легко обнаружена с помощью обычных методов.
РИА были одними из самых ранних разработанных иммуноанализов, но вышли из употребления в основном из-за сложности и потенциальных опасностей, связанных с работой с радиоактивностью. [8] [9]
Новый подход к иммуноанализам включает в себя объединение количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT qPCR) и традиционных методов иммуноанализа. Называемая иммуноколичественной ПЦР в реальном времени (iqPCR), метка, используемая в этих анализах, представляет собой ДНК- зонд. [10] [11]
Флуорогенные репортеры, такие как фикоэритрин, используются в ряде современных иммуноанализов. [12] Белковые микрочипы — это тип иммуноанализа, в котором часто используются флуорогенные репортеры. [13]
Некоторые метки работают по принципу электрохемилюминесценции (ЭХЛ), при которой метка излучает обнаруживаемый свет в ответ на электрический ток. [14] [15]
Хотя в иммуноанализах обычно используется какой-то вид метки, существуют определенные виды анализов, которые не полагаются на метки, а вместо этого используют методы обнаружения, которые не требуют модификации или маркировки компонентов анализа. Поверхностный плазмонный резонанс является примером метода, который может обнаружить связывание между немеченым антителом и антигенами. [16] Другой продемонстрированный иммуноанализ без метки включает измерение изменения сопротивления на электроде, когда антигены связываются с ним. [17]
Иммуноферментный анализ может проводиться в различных форматах. Как правило, иммуноферментный анализ попадает в одну из нескольких категорий в зависимости от того, как он проводится. [18]
В конкурентном гомогенном иммуноанализе немеченый аналит в образце конкурирует с меченым аналитом за связывание антитела. Затем измеряется количество меченого, несвязанного аналита. Теоретически, чем больше аналита в образце, тем больше меченого аналита вытесняется и затем измеряется; следовательно, количество меченого, несвязанного аналита пропорционально количеству аналита в образце.
.png/1280px-Homogeneous_competitive_assays_(FPIA,_EMIT,_LOCI,_KIMS_and_CEDIA).png)
Как и в конкурентном, гомогенном иммуноанализе, немеченый аналит в образце конкурирует с меченым аналитом за связывание антитела. В гетерогенных анализах меченый, несвязанный аналит отделяется или вымывается, а оставшийся меченый, связанный аналит измеряется.
Смешивая образец с мечеными антителами, целевой аналит связывается мечеными антителами. Несвязанные меченые антитела смываются, а связанные меченые антитела измеряются. Интенсивность сигнала прямо пропорциональна количеству аналита в образце.
Аналит в неизвестном образце связывается с сайтом антитела, затем меченое антитело связывается с аналитом. Затем измеряется количество меченого антитела на сайте. Оно будет прямо пропорционально концентрации аналита, поскольку меченое антитело не будет связываться, если аналит отсутствует в неизвестном образце. Этот тип иммуноанализа также известен как сэндвич-анализ, поскольку аналит «зажат» между двумя антителами.
Широкий спектр медицинских тестов — это иммуноанализы, называемые в этом контексте иммунодиагностикой. Многие домашние тесты на беременность — это иммуноанализы, которые определяют маркер беременности хорионический гонадотропин человека . [20] Более конкретно, это качественные тесты, которые определяют наличие ХГЧ с помощью установки с боковым потоком . [21] Быстрый тест на антиген COVID -19 также является качественным тестом с боковым потоком. [22]
Другие клинические иммуноанализы являются количественными; они измеряют количество. Иммуноанализы могут измерять уровни CK-MB для оценки заболеваний сердца, инсулина для оценки гипогликемии , простатоспецифического антигена для выявления рака простаты , а некоторые также используются для обнаружения и/или количественного измерения некоторых фармацевтических соединений (см. Метод иммуноферментного анализа с умножением ферментов для получения более подробной информации). [23]
Тестирование на наркотики также начинается с быстрого качественного иммуноанализа. [24]
Иммуноферментный анализ используется в спортивных антидопинговых лабораториях для проверки образцов крови спортсменов на наличие запрещенного рекомбинантного гормона роста человека (rhGH, rGH, hGH, GH). [25]
Фотоакустический иммуноанализ измеряет низкочастотные акустические сигналы, генерируемые метками металлических наночастиц . Освещенные модулированным светом на длине волны плазмонного резонанса, наночастицы генерируют сильный акустический сигнал, который можно измерить с помощью микрофона. [26] Фотоакустический иммуноанализ может применяться к тестам бокового потока, в которых используются коллоидные наночастицы. [27]
«Справочник по иммуноферментному анализу», 3-е издание, под ред. Дэвида Уайлда, Elsevier, 2008 г.