Иммунопреципитация хроматина ( ChIP ) — это тип экспериментального метода иммунопреципитации, используемый для исследования взаимодействия между белками и ДНК в клетке. Целью исследования является определение того, связаны ли определенные белки с определенными областями генома, такими как факторы транскрипции на промоторах или других участках связывания ДНК , и, возможно, определение цистром . ChIP также направлен на определение конкретного места в геноме, с которым связаны различные модификации гистонов , указывая цель модификаторов гистонов. [1] ChIP имеет решающее значение для достижений в области эпигеномики и изучения эпигенетических явлений. [2]
Вкратце, традиционный метод заключается в следующем:
ДНК и связанные белки хроматина в живых клетках или тканях сшиваются (этот этап опущен в Native ChIP).
Комплексы ДНК-белок (хроматин-белок) затем разрезаются на фрагменты ДНК размером ~ 500 п.н. путем обработки ультразвуком или расщепления нуклеазой.
Сшитые фрагменты ДНК, связанные с представляющим интерес белком(ами), селективно иммунопреципитируют из клеточного дебриса с использованием подходящего белок-специфического антитела.
Связанные фрагменты ДНК очищают и определяют их последовательность. Обогащение специфических последовательностей ДНК представляет собой области генома, с которыми интересующий белок связан in vivo .
Типичный чип
Различают в основном два типа ЧИП, отличающиеся, прежде всего, исходным препаратом хроматина. В первом используется обратимо сшитый хроматин, расщепленный ультразвуком , который называется сшитым ChIP (XChIP). Нативный ChIP (NChIP) использует нативный хроматин, расщепленный микрококковой нуклеазой . [ нужна цитата ]
Сшитый чип (XChIP)
Сшитый ChIP в основном подходит для картирования ДНК-мишени факторов транскрипции или других белков, связанных с хроматином, и использует обратимо сшитый хроматин в качестве исходного материала. Агентом обратимой сшивки может быть формальдегид [3] или УФ-свет . [4] Затем сшитый хроматин обычно разрезается ультразвуком, образуя фрагменты длиной 300–1000 пар оснований (п.н.). Для разрезания хроматина использовалось мягкое сшивание формальдегидом с последующим расщеплением нуклеазой. [5] Фрагменты хроматина размером 400–500 пар оснований оказались подходящими для анализов ChIP, поскольку они покрывают две-три нуклеосомы .
Клеточный мусор в расщепленном лизате затем очищается путем седиментации, а комплексы белок-ДНК селективно иммунопреципитируются с использованием специфических антител к интересующему белку(ам). Антитела обычно связывают с агарозой , сефарозой или магнитными шариками. Альтернативно, комплексы хроматин-антитело можно избирательно удерживать и элюировать с помощью инертных полимерных дисков. [6] [7] Иммунопреципитированные комплексы (т.е. комплекс шарик-антитело-белок-мишень последовательность ДНК) затем собирают и промывают для удаления неспецифически связанного хроматина, перекрестная сшивка белок-ДНК обращается вспять и белки удаляются. путем расщепления протеиназой К. Вместо антител к интересующему нативному белку можно использовать версию интересующего белка, меченную эпитопом , или биотинилирование in vivo [8] .
Нативный ChIP в основном подходит для картирования ДНК-мишени модификаторов гистонов . Обычно в качестве исходного хроматина используют нативный хроматин. Поскольку гистоны обволакивают ДНК, образуя нуклеосомы, они естественным образом связаны. Затем хроматин расщепляется микрококковой нуклеазой, которая разрезает ДНК по длине линкера, оставляя нуклеосомы неповрежденными и обеспечивая фрагменты ДНК длиной от одной нуклеосомы (200 п.н.) до пяти нуклеосом (1000 п.н.). После этого методы, аналогичные XChIP, используются для очистки клеточного мусора, иммунопреципитации интересующего белка, удаления белка из иммунопреципитированного комплекса, а также очистки и анализа ДНК, связанной с комплексом. [ нужна цитата ]
Сравнение ХЧИП и НЧИП
Основным преимуществом NChIP является специфичность антител . Важно отметить, что большинство антител к модифицированным гистонам вырабатываются против нефиксированных синтетических пептидных антигенов и что эпитопы, которые они должны распознавать в XChIP, могут быть разрушены или уничтожены сшивкой формальдегида , особенно потому, что сшивки, скорее всего, вовлекают e-аминогруппы лизина в N-концы, разрушая эпитопы. Вероятно, этим объясняется неизменно низкая эффективность протоколов XChIP по сравнению с NChIP.
Но ХЧИП и НЧИП имеют разные цели и преимущества по отношению друг к другу. XChIP предназначен для картирования целевых сайтов факторов транскрипции и других белков, связанных с хроматином; NChIP предназначен для картирования целевых сайтов модификаторов гистонов (см. Таблицу 1).
Сравнение ChIP-seq и ChIP-чипа
Секвенирование иммунопреципитации хроматина, также известное как ChIP-seq , представляет собой экспериментальный метод, используемый для идентификации событий связывания факторов транскрипции по всему геному . Знание того, как белки в организме человека взаимодействуют с ДНК, регулируя экспрессию генов, является ключевым компонентом наших знаний о болезнях человека и биологических процессах. ChIP-seq является основным методом решения этой задачи, поскольку он оказался чрезвычайно эффективным в определении того, как белки и факторы транскрипции влияют на фенотипические механизмы. В целом ChIP-seq стал очень эффективным методом определения этих факторов, но существует конкурирующий метод, известный как ChIP-on-chip.
ChIP-on-chip , также известный как ChIP-чип, представляет собой экспериментальный метод, используемый для выделения и идентификации геномных участков, занятых специфическими ДНК-связывающими белками в живых клетках. Чип-на-чипе — относительно новый метод, поскольку он был представлен в 2001 году Пегги Фарнхэм и Майклом Чжаном. «ЧИП-на-чипе» получил свое название в результате объединения методов иммунопреципитации хроматина и микрочипа ДНК , в результате чего был создан «ЧИП-на-чипе».
Оба метода добиваются схожих результатов, поскольку оба стремятся найти сайты связывания белков, которые могут помочь идентифицировать элементы в геноме человека. Эти элементы человеческого генома важны для развития знаний о болезнях человека и биологических процессах. Разница между ChIP-seq и ChIP-чипом определяется определением конкретного сайта связывания белка. Основное различие заключается в эффективности двух методов: ChIP-seq дает результаты с более высокой чувствительностью и пространственным разрешением из-за широкого диапазона геномного покрытия. Несмотря на то, что ChIP-seq оказался более эффективным, чем ChIP-чип, ChIP-seq не всегда является лучшим выбором для ученых. Стоимость и доступность ChIP-seq являются основным недостатком, который привел к более широкому использованию ChIP-чипов в лабораториях по всему миру. [2]
На этой фотографии сравнивается эффективность двух экспериментальных методов: ChIP-seq и ChIP-chip.
Таблица 1. Преимущества и недостатки НЧИП и ХЧИП
История и новые методы ЧИП
In 1984 John T. Lis and David Gilmour, at the time a graduate student in the Lis lab, used UV irradiation, a zero-length protein-nucleic acid crosslinking agent, to covalently cross-link proteins bound to DNA in living bacterial cells. Following lysis of cross-linked cells and immunoprecipitation of bacterial RNA polymerase, DNA associated with enriched RNA polymerase was hybridized to probes corresponding to different regions of known genes to determine the in vivo distribution and density of RNA polymerase at these genes. A year later they used the same methodology to study the distribution of eukaryotic RNA polymerase II on fruit fly heat shock genes. These reports are considered the pioneering studies in the field of chromatin immunoprecipitation.[9][10] XChIP was further modified and developed by Alexander Varshavsky and co-workers, who examined the distribution of histone H4 on heat shock genes using formaldehyde cross-linking.[11][12] This technique was extensively developed and refined thereafter.[13]NChIP approach was first described by Hebbes et al., 1988,[14] and has also been developed and refined quickly.[15] The typical ChIP assay usually takes 4–5 days and requires 106~ 107 cells at least. Now new techniques on ChIP could be achieved as few as 100~1000 cells and completed within one day.
Bead-free ChIP: This novel method ChIP uses discs of inert, porous polymer functionalized with either Protein A or G in spin columns or microplates. The chromatin-antibody complex is selectively retained by the disc and eluted to obtain enriched DNA for downstream applications such as qPCR and sequencing. The porous environment is specifically designed to maximize capture efficiency and reduce non-specific binding. Due to less manual handling and optimized protocols, ChIP can be performed in 5 hours.[7]
Carrier ChIP (CChIP): This approach could use as few as 100 cells by adding Drosophila cells as carrier chromatin to reduce loss and facilitate precipitation of the target chromatin. However, it demands highly specific primers for detection of the target cell chromatin from the foreign carrier chromatin background, and it takes two to three days.[16]
Быстрый ChIP (qChIP): быстрый анализ ChIP сократил время за счет сокращения двух этапов типичного анализа ChIP: (i) ультразвуковая ванна ускоряет скорость связывания антител с целевыми белками и тем самым сокращает время иммунопреципитации (ii) смола- Процедура выделения ДНК на основе Chelex-100 сокращает время обращения перекрестных связей и выделения ДНК. Однако быстрый протокол подходит только для крупных образцов клеток (в диапазоне 10 6 ~ 10 7 ). [17] [18] Можно обработать до 24 образцов расщепленного хроматина, чтобы получить ДНК, готовую к ПЦР, за 5 часов, что позволяет одновременно исследовать несколько факторов хроматина и/или наблюдать за геномными событиями в течение нескольких моментов времени. [19]
Быстрый и количественный ChIP (Q 2 ChIP): В анализе используются 100 000 клеток в качестве исходного материала, и он подходит для до 1000 чипов гистонов или 100 чипов транскрипционных факторов. Таким образом, можно одновременно приготовить и сохранить множество образцов хроматина, а Q 2 ChIP можно провести за один день. [20]
МикроЧИП (мкЧИП): хроматин обычно готовят из 1000 клеток, и до 8 ЧИП можно делать параллельно без носителей. Анализ также можно начать со 100 клеток, но подходит только для одного чипа. Также можно использовать небольшие (1 мм 3 ) биопсии тканей и микрочип можно сделать в течение одного дня. [21] [22]
Matrix ChIP : это анализ ChIP на микропланшете с повышенной производительностью и упрощенной процедурой. Все этапы выполняются в лунках микропланшета без переноса проб, что дает возможность автоматизации. Он позволяет проводить 96 анализов ChIP на гистоны и различные ДНК-связанные белки за один день. [23]
Патологический ChIP (PAT-ChIP): этот метод позволяет использовать ChIP из патологических тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин, и, таким образом, использовать архивы патологий (даже те, которым несколько лет) для эпигенетического анализа и идентификации потенциальных эпигенетических биомаркеров или цели. [24]
Крупномасштабные анализы с использованием ChIP представляют собой сложную задачу с использованием интактных модельных организмов. Это связано с тем, что для каждого ТФ необходимо генерировать антитела или, альтернативно, необходимо создавать трансгенные модельные организмы, экспрессирующие ТФ, меченные эпитопом.
Исследователи, изучающие дифференциальные закономерности экспрессии генов в небольших организмах, также сталкиваются с проблемами, поскольку гены экспрессируются на низких уровнях, в небольшом количестве клеток и в узком временном окне.
Эксперименты с ChIP не могут различать разные изоформы TF ( изоформы белка ).
Смотрите также
ChIP-exo , метод, который добавляет обработку экзонуклеазой к процессу ChIP для получения разрешения сайтов связывания до одной пары оснований.
Чип-на-чипе , сочетает в себе чип с технологией микрочипов.
DamID , альтернативный метод картирования местоположения, не требующий специфических антител.
RIP-Chip , аналогичный метод анализа взаимодействий РНК-белок.
^ аб Розенфельд, Джон М; Кук, Трейси; Ли, Цзыронг; Сайто, Кан; Таганов Константин; Тьягараджан, Бхаскар; Солаш, Алехандра (март 2013 г.). «Систематическая оптимизация параметров, участвующих в процессе подготовки хроматина и иммунопреципитации хроматина (ChIP)». Эпигенетика и хроматин . 6 (С1): П122, 1756–8935–6-С1-П122. дои : 10.1186/1756-8935-6-S1-P122 . ISSN 1756-8935. ПМК 3620580 .
^ Джексон, Вон (ноябрь 1978 г.). «Исследования организации гистонов в нуклеосоме с использованием формальдегида в качестве обратимого сшивающего агента». Клетка . 15 (3): 945–54. дои : 10.1016/0092-8674(78)90278-7. PMID 569554. S2CID 25169609.
^ Гилмор Д.С., Лис Дж.Т. (август 1985 г.). «Взаимодействие РНК-полимеразы II in vivo с генами Drosophila melanogaster». Молекулярная и клеточная биология . 5 (8): 2009–18. дои : 10.1128/mcb.5.8.2009. ПМК 366919 . ПМИД 3018544.
^ Бауэр У.М., Даужат С., Нильсен С.Дж., Найтингейл К., Кузаридес Т. (январь 2002 г.). «Метилирование аргинина 17 гистона H3 связано с активацией гена». Отчеты ЭМБО . 3 (1): 39–44. doi : 10.1093/embo-reports/kvf013. ПМЦ 1083932 . ПМИД 11751582.
^ Бейнон, Эми Л.; Паркс, Линдси Дж.; Тернер, Мэтью Л.; Найт, Стив; Конлан, Стив; Фрэнсис, Льюис; Стокс, Бен (сентябрь 2014 г.). «Chromatrap® 96: новая твердотельная платформа для высокопроизводительного чипа». Природные методы . 11 (9): i – ii. дои : 10.1038/nmeth.f.372 . ISSN 1548-7091.
^ аб "Хромаловушка".Революционная твердотельная платформа для иммунопреципитации хроматина.
^ Вьенс А; и другие. (2004). «Использование биотинилирования белков in vivo для иммунопреципитации хроматина». Аналитическая биохимия . 325 (1): 68–76. дои : 10.1016/j.ab.2003.10.015. ПМИД 14715286.
^ Гилмор Д.С., Лис Дж.Т. (август 1985 г.). «Взаимодействие РНК-полимеразы II in vivo с генами Drosophila melanogaster». Мол. Клетка. Биол . 5 (8): 2009–18. дои : 10.1128/mcb.5.8.2009. ПМК 366919 . ПМИД 3018544.
^ Варшавский А (декабрь 2008 г.). «Открытие клеточной регуляции путем деградации белка». Журнал биологической химии . 283 (50): 34469–89. дои : 10.1074/jbc.X800009200 . ПМК 3259866 . ПМИД 18708349.
^ Соломон, Марк Дж; Ларсен Памела Л; Варшавский, Александр. (июнь 1988 г.). «Картирование взаимодействий белок-ДНК in vivo с формальдегидом: свидетельства того, что гистон H4 сохраняется в хорошо транскрибируемом гене». Клетка . 53 (6): 937–47. дои : 10.1016/S0092-8674(88)90469-2. PMID 2454748. S2CID 11169130.
^ Орландо V (март 2000 г.). «Картирование хромосомных белков in vivo путем иммунопреципитации хроматина, сшитого формальдегидом». Тенденции биохимических наук . 25 (3): 99–104. дои : 10.1016/S0968-0004(99)01535-2. ПМИД 10694875.
^ Хеббес, Тим Р.; Торн, Алан В.; Крейн-Робинсон С (май 1988 г.). «Прямая связь между ацетилированием основных гистонов и транскрипционно активным хроматином». Журнал ЭМБО . 7 (5): 1395–402. doi :10.1002/j.1460-2075.1988.tb02956.x. ПМК 458389 . ПМИД 3409869.
^ О'Нил, Лаура П; Тернер, Брайан М. (сентябрь 2003 г.). «Иммунопреципитация нативного хроматина: НЧИП». Методы . 31 (1): 76–82. дои : 10.1016/S1046-2023(03)00090-2. ПМИД 12893176.
^ О'Нил, Лаура П; ВерМильеа, Мэтью Д.; Тернер, Брайан М. (июль 2006 г.). «Эпигенетическая характеристика раннего эмбриона с помощью протокола иммунопреципитации хроматина, применимого к небольшим популяциям клеток». Природная генетика . 38 (7): 835–41. дои : 10.1038/ng1820. PMID 16767102. S2CID 28311996.
^ Нельсон, Джоэл Д; Денисенко Олег; Сова, Павел; Бомштык, Кароль (2006). «Анализ быстрой иммунопреципитации хроматина». Исследования нуклеиновых кислот . 34 (1): e2. doi : 10.1093/nar/gnj004. ПМЦ 1325209 . ПМИД 16397291.
^ Нельсон, Джоэл Д; Денисенко Олег; Бомштык, Кароль (2006). «Протокол метода быстрой иммунопреципитации хроматина (ЧИП)». Протоколы природы . 1 (1): 179–85. дои : 10.1038/nprot.2006.27. PMID 17406230. S2CID 20577722.
^ Даль, Джон Арн; Коллас, Филипп (апрель 2007 г.). «Q2ChIP, быстрый и количественный анализ иммунопреципитации хроматина, раскрывает эпигенетическую динамику генов, регулируемых развитием, в клетках карциномы человека». Стволовые клетки . 25 (4): 1037–46. doi : 10.1634/stemcells.2006-0430 . ПМИД 17272500.
^ Даль, Джон Арн; Коллас, Филипп (2008). «Быстрый анализ иммунопреципитации микрохроматина (микроЧИП)». Протоколы природы . 3 (6): 1032–45. дои : 10.1038/nprot.2008.68. PMID 18536650. S2CID 29529307.
^ Даль, Джон Арн; Коллас, Филипп (2009). «μChIP: Иммунопреципитация хроматина для небольшого количества клеток». Анализы иммунопреципитации хроматина . Методы молекулярной биологии . Том. 567. стр. 59–74. дои : 10.1007/978-1-60327-414-2_4. ISBN978-1-60327-413-5. ПМИД 19588085.
^ Фланагин, Стив; Нельсон, Джоэл Д; Кастнер, Дэвид Дж; Денисенко Олег; Бомштык, Кароль (февраль 2008 г.). «Метод иммунопреципитации хроматина на микропланшете, Matrix ChIP: платформа для изучения передачи сигналов сложных геномных событий». Исследования нуклеиновых кислот . 36 (3): е17. дои : 10.1093/nar/gkn001. ПМК 2241906 . ПМИД 18203739.
^ Фанелли, Мирко; Аматори, Стефано; Бароцци, Ирос; Сончини, Матиас; Суффо, Роберто Даль; Буччи, Габриэле; Капра, Мария; Куарто, Микаэла; Деллино, Гаэтано Иван (14 декабря 2010 г.). «Иммунопреципитация патологической ткани – хроматина в сочетании с высокопроизводительным секвенированием позволяет составить эпигенетическое профилирование образцов пациентов». Труды Национальной академии наук . 107 (50): 21535–21540. Бибкод : 2010PNAS..10721535F. дои : 10.1073/pnas.1007647107 . ISSN 0027-8424. ПМК 3003125 . ПМИД 21106756.
^ Фуллвуд, Мелисса Дж; Хан, Ююань; Вэй, Цзя-Линь; Жуань, Сяоань; Жуан, Иджун (январь 2010 г.). Анализ взаимодействия хроматина с использованием секвенирования парных концевых меток . Том. Глава 21. С. Раздел 21.15.1–25. дои : 10.1002/0471142727.mb2115s89. ISBN978-0471142720. ПМК 6924956 . ПМИД 20069536. {{cite book}}: |journal=игнорируется ( помощь )
^ «ChIA-PET: новый метод исследования трехмерного картирования всего генома» . ScienceDaily . Агентство по науке, технологиям и исследованиям (A*STAR), Сингапур. 08.11.2009 . Проверено 14 марта 2010 г.
Внешние ссылки
На Wikimedia Commons есть средства массовой информации, связанные с иммунопреципитацией хроматина .
