Иммуноэлектрофорез — общее название ряда биохимических методов разделения и характеристики белков, основанных на электрофорезе и реакции с антителами . Все варианты иммуноэлектрофореза требуют иммуноглобулинов , также известных как антитела , реагирующих с белками, которые необходимо разделить или охарактеризовать. Методы были разработаны и широко использовались во второй половине 20-го века. В некотором хронологическом порядке: иммуноэлектрофоретический анализ (одномерный иммуноэлектрофорез ad modum Grabar), перекрестный иммуноэлектрофорез (двумерный количественный иммуноэлектрофорез ad modum Clarke and Freeman или ad modum Laurell), ракетный иммуноэлектрофорез (одномерный количественный иммуноэлектрофорез ad modum Laurell), слитый ракетный иммуноэлектрофорез ad modum Svendsen and Harboe, аффинный иммуноэлектрофорез ad modum Bøg-Hansen.
Иммуноэлектрофорез — это общий термин, описывающий множество комбинаций принципов электрофореза и реакции антител , также известной как иммунодиффузия. [1]
Агароза в виде 1% гелевых пластин толщиной около 1 мм, забуференных при высоком pH (около 8,6), традиционно предпочтительна для электрофореза и реакции с антителами. Агароза была выбрана в качестве гелевой матрицы, поскольку она имеет большие поры, обеспечивающие свободный проход и разделение белков, но обеспечивает якорь для иммунопреципитатов белка и специфических антител. Высокий pH был выбран, поскольку антитела практически неподвижны при высоком pH. Для электрофореза обычно рекомендовалось оборудование для электрофореза с горизонтальной охлаждающей пластиной.
Иммунопреципитаты видны во влажном агарозном геле, но окрашиваются белковыми красителями, такими как Кумасси бриллиантовый синий, в высушенном геле. В отличие от электрофореза в SDS-геле , электрофорез в агарозе допускает нативные условия, сохраняя нативную структуру и активность исследуемых белков, поэтому иммуноэлектрофорез позволяет характеризовать активность ферментов и связывание лигандов и т. д. в дополнение к электрофоретическому разделению.
Контриммуноэлектрофорез — это комбинация иммунодиффузии с электрофорезом. По сути, электрофорез ускоряет процесс перемещения реагентов вместе.
Иммуноэлектрофоретический анализ ad modum Grabar является классическим методом иммуноэлектрофореза. Белки разделяются электрофорезом, затем антитела наносятся в желоб рядом с разделенными белками, и иммунопреципитаты образуются после периода диффузии разделенных белков и антител друг против друга. Введение иммуноэлектрофоретического анализа дало большой толчок химии белков, одними из первых результатов стали разделение белков в биологических жидкостях и биологических экстрактах. Среди важных наблюдений были большое количество различных белков в сыворотке, существование нескольких классов иммуноглобулинов и их электрофоретическая гетерогенность.
Перекрестный иммуноэлектрофорез также называется двумерным количественным иммуноэлектрофорезом ad modum Clarke and Freeman или ad modum Laurell. В этом методе белки сначала разделяются во время электрофореза первого измерения, затем вместо диффузии к антителам белки электрофорезируются в гель, содержащий антитела, во втором измерении. Иммунопреципитация будет происходить во время электрофореза второго измерения, и иммунопреципитаты будут иметь характерную форму колокола, каждый осадок представляет один антиген, положение осадка зависит от количества белка, а также от количества специфического антитела в геле, поэтому можно выполнить относительную количественную оценку. Чувствительность и разрешающая способность перекрестного иммуноэлектрофореза выше, чем у классического иммуноэлектрофоретического анализа, и существует множество вариаций этой методики, полезных для различных целей. Перекрестный иммуноэлектрофорез использовался для изучения белков в биологических жидкостях, в частности, в сыворотке человека и биологических экстрактах.
Ракетный иммуноэлектрофорез — одномерный количественный иммуноэлектрофорез. Метод использовался для количественного определения белков сыворотки человека до того, как стали доступны автоматизированные методы.
Ракетный иммуноэлектрофорез с плавленым слоем представляет собой модификацию одномерного количественного иммуноэлектрофореза, используемую для детального измерения белков во фракциях в экспериментах по разделению белков.
Аффинный иммуноэлектрофорез основан на изменениях в электрофоретическом паттерне белков посредством специфического взаимодействия или комплексообразования с другими макромолекулами или лигандами. Аффинный иммуноэлектрофорез использовался для оценки констант связывания , например, с лектинами или для характеристики белков со специфическими характеристиками, такими как содержание гликанов или связывание лигандов . Некоторые варианты аффинного иммуноэлектрофореза похожи на аффинную хроматографию за счет использования иммобилизованных лигандов .
Связывание лигандов. Открытая структура иммунопреципитата в агарозном геле позволит дополнительно связывать радиоактивно меченые антитела и другие лиганды для выявления специфических белков. Применение этой возможности использовалось, например, для идентификации аллергенов через реакцию с иммуноглобулином E (IgE) и для идентификации гликопротеинов с лектинами .
Общие комментарии. Два фактора определяют, что иммуноэлектрофоретические методы не получили широкого распространения. Во-первых, они довольно трудоемки и требуют определенного ручного опыта. Во-вторых, они требуют довольно большого количества поликлональных антител. Сегодня гель-электрофорез с последующим электроблоттингом является предпочтительным методом для характеристики белков из-за его простоты эксплуатации, высокой чувствительности и низкой потребности в специфических антителах. Кроме того, белки разделяются гель-электрофорезом на основе их кажущейся молекулярной массы, чего нельзя достичь с помощью иммуноэлектрофореза, но тем не менее иммуноэлектрофоретические методы все еще полезны, когда требуются невосстанавливающие условия.
Контриммуноэлектрофорез и его модификации
По сравнению с другими традиционными методами диагностики, например, для тестирования на вирусную инфекцию, встречный иммуноэлектрофорез является высокоспецифичным, простым и быстрым методом, который не требует сложных, дорогих инструментов, исходных материалов или долгосрочного наращивания потенциала. Учитывая высокую информативность встречного иммуноэлектрофореза, результаты на практике порой могут быть сомнительными. В результате, используя изготовленный амфифильный флуоресцеинсодержащий сополимер для увеличения взаимодействия антигена и антитела, процедуры встречного иммуноэлектрофореза могут быть улучшены. Использование смеси флуоресцеинового сополимера и антигена улучшило ассоциацию с уровнями антител в плазме животных, иммунизированных против геморрагической болезни, и повысило концентрацию белка в преципитированной зоне, согласно результатам. Способность амфифильного флуоресцеинового сополимера усиливать ассоциацию антиген-антитело и видеть флуоресцентный домен накопления может повысить эффективность встречного иммуноэлектрофореза для быстрой диагностики инфекционных заболеваний. [3]
Иммунометоды
Терминология, иммунные методы и иммунохимические методы относятся к различным процессам иммуноэлектрофореза, результаты которых определяются с использованием антител и иммунологических методологий. [4] В результате высокая чувствительность иммунометодов является преимуществом по сравнению с большими расходами на использование антител. Многие различные типы агарозного электрофореза используются для того, чтобы увидеть, как белки перемещаются в различных обстоятельствах. Белки распознаются после истечения таймера путем инкубации гелей с определенными антителами, которые затем окрашиваются синим Комасси. [5]
Радиальная иммунодиффузия
Радиальная иммунодиффузия — это метод иммуноанализа для определения концентрации определенного белка в смеси, включающей другие модули. Он состоит из агарозного геля, как и другие. Кроме того, в этой процедуре материалы помещаются в круглые лунки в центральной части геля и рассеиваются через него, образуя кольцо осаждения с диаметром, соответствующим количеству несвязанного белка, который диффундировал. [4]
Выявление взаимодействия наноматериалов с комплементом белка C3 и 2D иммуноэлектрофорезом
2D иммуноэлектрофорез является потенциальным методом, который может быть использован для ряда функций, связанных с потоком белков мигрантов, таких как глубокое исследование опсонизации белков, в последовательности первого измерения как активности молярной массы белка и второго измерения как роли изоэлектрической точки. Несмотря на то, что он содержит большое количество белков, каждое пятно на 2D геле будет символизировать определенный белок с определенной молекулярной массой и особенностью. [5]
2D иммуноэлектрофорез также предоставляется как ценный инструмент для изучения стимуляции пути передачи сигнала, что является существенным фактором в исследовании наночастиц перед доставкой in vivo, поскольку это повлияет на долговечность наночастиц, место назначения и биораспределение. Этот метод использует двумерный горизонтальный электрофорез белка агарозы для специфической идентификации ассоциации наночастиц с белком C3. Белки могут быть разделены в первом измерении в соответствии с их молекулярной массой (чем короче белок, тем дальше он дрейфует), а во втором измерении в соответствии с их распространенностью [6]
Некоторые ограничения иммуноэлектрофореза
Хотя иммуноэлектрофорез имеет ряд преимуществ, он также имеет определенные недостатки, например, по сравнению с другими методами электрофореза, такими как иммунофиксация, этот метод медленный и менее точный. Может быть сложно интерпретировать результаты. Несколько крошечных моноклональных белков может быть сложнее идентифицировать. Доступность определенных антител ограничивает его полезность в аналитических методах. Традиционный (классический или обычный) иммуноэлектрофорез имеет ряд недостатков, включая тот факт, что он занимает много времени, а протокол может занять до 3 дней, имеет ограниченную специфичность и чувствительность, а результаты могут быть трудночитаемыми. В результате новые методы иммуноэлектрофореза в значительной степени вытеснили обычный иммуноэлектрофорез.