Карбоксипептидаза А обычно относится к панкреатической экзопептидазе , которая гидролизует пептидные связи C-концевых остатков с ароматическими или алифатическими боковыми цепями . Большинство ученых в этой области теперь называют этот фермент CPA1 , а родственную панкреатическую карбоксипептидазу — CPA2 .
Кроме того, есть 4 других фермента млекопитающих, называемых CPA-3 — CPA-6, и ни один из них не экспрессируется в поджелудочной железе. Вместо этого, эти другие CPA-подобные ферменты имеют различные функции.
CPA-1 и CPA-2 (и, как предполагается, все остальные CPA) используют ион цинка в белке для гидролиза пептидной связи на С-конце аминокислотного остатка. Потеря цинка приводит к потере активности, которая может быть легко заменена цинком, а также некоторыми другими двухвалентными металлами ( кобальтом , никелем ). Карбоксипептидаза А вырабатывается в поджелудочной железе и имеет решающее значение для многих процессов в организме человека, включая пищеварение, посттрансляционную модификацию белков, свертывание крови и воспроизводство.
Этот широкий спектр функциональности для одного белка делает его идеальной моделью для исследования других цинковых протеаз неизвестной структуры. Недавние биомедицинские исследования коллагеназы, энкефалиназы и ангиотензинпревращающего фермента использовали карбоксипептидазу А для синтеза ингибиторов и кинетического тестирования. Например, препарат для лечения высокого кровяного давления, Каптоприл, был разработан на основе ингибитора карбоксипептидазы А. Карбоксипептидаза А и целевой фермент Каптоприла, ангиотензинпревращающий фермент, имеют очень похожие структуры, поскольку они оба содержат ион цинка в активном центре. Это позволило использовать мощный ингибитор карбоксипептидазы А для ингибирования фермента и, таким образом, снижения кровяного давления через систему ренин-ангиотензин-альдостерон. [1]
Карбоксипептидаза A (CPA) содержит цинковый (Zn 2+ ) металлический центр в тетраэдрической геометрии с аминокислотными остатками в непосредственной близости вокруг цинка для облегчения катализа и связывания. Из 307 аминокислот, связанных в пептидную цепь, следующие аминокислотные остатки важны для катализа и связывания: Glu-270, Arg-71, Arg-127, Asn-144, Arg-145 и Tyr-248. На рисунке 1 показан тетраэдрический активный центр цинкового комплекса с важными аминокислотными остатками, которые окружают комплекс. [2]
Металлический цинк является сильным электрофильным катализатором кислоты Льюиса, который стабилизирует координированную молекулу воды, а также стабилизирует отрицательные промежуточные продукты, которые возникают в ходе гидролитической реакции. Стабилизация как координированной молекулы воды, так и отрицательных промежуточных продуктов осуществляется с помощью полярных остатков в активном центре, которые находятся в непосредственной близости, чтобы способствовать образованию водородных связей. [2]
Активный сайт можно охарактеризовать как два подсайта, обозначенных как S 1 ' и S 1 . Подсайт S 1 ' является гидрофобным карманом фермента, и Tyr-248 действует как «крышка» гидрофобного кармана после связывания субстрата или ингибитора (SITE). [2] Водородная связь от гидроксильной группы в Tyr-248 облегчает эту конформацию из-за взаимодействия с концевыми карбоксилатами субстратов, которые связываются. Для этого фермента требуется существенное движение, и модель индуцированного соответствия объясняет, как происходит это взаимодействие.
Триада остатков взаимодействует с С-концевым карбоксилатом посредством водородных связей:
Классифицированная как металлоэкзопептидаза, карбоксипептидаза А состоит из одной полипептидной цепи, связанной с ионом цинка. Этот характерный ион металла расположен в активном центре фермента вместе с пятью аминокислотными остатками, которые участвуют в связывании субстрата: Arg-71, Arg-127, Asn-144, Arg-145, Tyr-248 и Glu-270. Рентгеноструктурные кристаллографические исследования выявили пять субсайтов на белке. Эти аллостерические сайты участвуют в создании специфичности лиганд-фермент, наблюдаемой в большинстве биоактивных ферментов. Один из этих субсайтов вызывает конформационное изменение в Tyr-248 при связывании молекулы субстрата в первичном активном центре. Фенольный гидроксил тирозина образует водородную связь с терминальным карбоксилатом лиганда. Кроме того, вторая водородная связь образуется между тирозином и пептидной связью более длинных пептидных субстратов. Эти изменения делают связь между ферментом и лигандом, будь то субстрат или ингибитор, намного прочнее. Это свойство карбоксипептидазы А привело к первому пункту гипотезы «индуцированного соответствия» Дэниела Э. Кошланда-младшего .
Подучасток S 1 находится там, где катализ происходит в CPA, а ион цинка координируется остатками фермента Glu-72, His-69 и His-196. Существует плоскость, которая делит пополам бороздку активного центра, где остатки Glu-270 и Arg-127 находятся на противоположных сторонах комплекса цинк-вода. Цинк богат электронами из-за лигандов глутамина, координирующих цинк, поскольку до связывания субстрата Glu-72 координируется бидентатно, но переходит в монодентатное состояние после связывания субстрата. В результате металлический цинк не способен депротонировать координированную молекулу воды, чтобы создать гидроксильный нуклеофил. [2]
Glu-270 и Arg-127 играют важную роль в катализе, показанном на рисунке 2. Arg-127 действует, стабилизируя карбонил субстрата, который связан с аминогруппой фенилаланина. Одновременно молекула воды, координированная с цинком, депротонируется Glu-270 и взаимодействует с карбонилом, стабилизированным Arg-127. Это создает промежуточное соединение, показанное на рисунке 2, где отрицательно заряженный кислород координируется с цинком, и через неблагоприятные электростатические взаимодействия между Glu-270 и ионизированным продуктом облегчает высвобождение продукта в конце катализа. [2]
В недавних вычислительных исследованиях механизм катализа похож, но разница в механизме заключается в том, что депротонированная молекула воды связывается с углеродом карбонила, тогда как на рисунке 2 показано, что гидроксильная группа остается координированной с цинком. Затем происходит протеолиз, и молекула воды затем вводится обратно в активный центр для координации с цинком. [3]
Было проведено несколько исследований, изучающих детали связи между карбоксипептидазой А и субстратом и то, как это влияет на скорость гидролиза. В 1934 году было впервые обнаружено с помощью кинетических экспериментов, что для связывания субстрата пептид, который должен быть гидролизован, должен быть рядом с терминальной свободной гидроксильной группой. Кроме того, скорость гидролиза может быть увеличена, если С-концевой остаток является разветвленным алифатическим или ароматическим. Однако, если субстрат представляет собой дипептид со свободной аминогруппой, он подвергается гидролизу медленно; этого, однако, можно избежать, если аминогруппа заблокирована N-ацилированием. [4]
Совершенно очевидно, что структура фермента, а точнее активного центра, очень важна для понимания механизма реакции. По этой причине Риз и его коллеги изучали комплекс фермент-лиганд, чтобы получить четкий ответ о роли иона цинка. Эти исследования показали, что в свободном ферменте координационное число цинка равно пяти; металлический центр координируется с двумя имидазольными атомами азота Nδ1, двумя карбоксилатными атомами кислорода глутамата-72 и молекулой воды, образуя искаженный тетраэдр. Однако, как только лиганд связывается с активным центром карбоксипептидазы А, это координационное число может варьироваться от пяти до шести. При связывании с дипептидом глицил-L-тирозином аминоазот дипептида и карбонильный кислород заменяют водный лиганд. Это дает координационное число шесть для цинка в комплексе карбоксипептидаза А-дипептид глицил-L-тирозин. Карты электронной плотности показали, что аминоазот занимает вторую позицию около глутамата-270. Близость этих двух остатков может привести к стерическому затруднению, препятствующему координации водного лиганда с цинком. Это приведет к координационному числу пять. Данные для обоих случаев существенны, что указывает на то, что обе ситуации встречаются в природе. [5]
Существует два предложенных механизма каталитической функции карбоксипептидазы А. Первый — нуклеофильный путь, включающий ковалентный ацил-ферментный промежуточный продукт, содержащий активную центральную базу Glu-270. Доказательства этого ангидридного промежуточного продукта неоднозначны; Су и его коллеги выделили то, что, как предполагается, является ацил-промежуточным продуктом. Однако подтверждение ацил-фермента было сделано без экспериментов по улавливанию, что делает выводы слабыми. [1]
Второй предложенный механизм — это промотированный водный путь. Этот механизм включает атаку молекулы воды на разрывную пептидную связь субстрата. Этот процесс промотируется ионом цинка и поддерживается остатком Glu-270. [1]
