stringtranslate.com

Катехолоксидаза

Катехолоксидаза — это медная оксидаза , которая содержит димедный кофактор типа 3 и катализирует окисление ортодифенолов в ортохиноны в сочетании с восстановлением молекулярного кислорода до воды. Она присутствует во множестве видов растений и грибов, включая Ipomoea batatas ( батат ) [1] и Camellia sinensis ( индийский чай). [2] Металлоферменты с медными центрами типа 3 характеризуются способностью обратимо связывать дикислород в условиях окружающей среды. [3] В растениях катехолоксидаза играет ключевую роль в ферментативном потемнении , катализируя окисление катехола до о-хинона в присутствии кислорода, который может быстро полимеризоваться с образованием меланина , который придает поврежденным плодам темно-коричневую окраску.

Биологическая функция

Общая реакция, катализируемая катехолоксидазой: образование двух о-хинонов и двух молекул воды из двух молекул катехола и одной молекулы дикислорода.

Полифенолоксидазы — это семейство димедных металлоферментов, включающее тирозиназу и катехолоксидазу. [4] В растениях оба фермента могут катализировать окисление субстратов орто-дифенолов в соответствующие им орто-хиноны. Ключевое различие между двумя родственными ферментами заключается в том, что тирозиназа может катализировать гидроксилирование монофенолов в дифенолы (монофенолазная активность), а также окисление о-дифенола в о-хинон (дифенолазная активность), тогда как катехолоксидаза обладает только дифенолазной активностью. [5]

При повреждении растительной ткани хлоропласт может разорваться и высвободить катехолоксидазу в цитоплазму растения, а вакуоли также могут разорваться, высвободив накопленный катехол в цитоплазму. Повреждение ткани также позволяет кислороду проникать в клетку. Таким образом, повреждение ткани облегчает взаимодействие катехолоксидазы с ее субстратом для получения о-бензохинона, который может полимеризоваться неферментативно с образованием меланинов, которые образуют нерастворимый барьер для защиты ран. [6]

Протеолитическая обработка

Катехолоксидаза кодируется в ядре, а ее N-конец содержит сигнальный пептид , который направляет белок в просвет тилакоида хлоропласта , где он может быть либо растворимым, либо слабо связанным с мембраной тилакоида. [7] Первоначально транскрибируемый как профермент , предшественник катехолоксидазы проходит два раунда протеолитической обработки и транспорта, прежде чем он попадет в просвет тилакоида.

Используя [ 35 S] метионин-меченый предшественник белка, Соммер и др. выяснили путь протеолитической обработки, общий для различных растений, включая горох ( Pisum sativum ), томат ( Lycopersicon esculentum ) и кукурузу ( Zea mays ). [8] Предшественник 67 кДа был импортирован в строму АТФ -зависимым образом , где стромальная пептидаза перерабатывает предшественника в промежуточное соединение 62 кДа. Транслокация этого промежуточного соединения в просвет тилакоида была светозависимой и приводит к образованию зрелого фермента 59 кДа. [9] На основе анализа предшественника и зрелой катехолоксидазы, очищенной из Ipomoea batatas , протеолитическая обработка удаляет как N-концевой транзитный пептид, так и C-концевой домен, который покрывает активный сайт фермента. [10]

Структура фермента

Активный центр димеди восстановленной (Cu(I)-Cu(I)) и нативной (Cu(II)-Cu(II)) катехолоксидазы из кристаллической структуры Ipomoea batata (батат) (PDB: 1BT1, 1BT2).

Кристаллическая структура катехолоксидазы, очищенной из Ipomoea batatas, была разрешена в ее активной форме как в окисленном состоянии Cu(II)-Cu(II), так и в восстановленном состоянии Cu(I)-Cu(I). [11] Это глобулярный однодоменный мономерный фермент размером приблизительно 55 на 45 на 45 Å и эллипсоидной формы. Четырехспиральный пучок α-спиралей составляет ядро ​​фермента, которое опоясывает активный сайт, содержащий димедный центр. [12] Атомы азота на имидазольных боковых цепях His 88, His109 и His118 координируются с первым каталитическим медным атомом, в то время как атомы азота на имидазольных боковых цепях His240, His244 и His274 координируются со вторым каталитическим ионом меди. В окисленном состоянии Cu(II)-Cu(II) каждый ион меди обладает четырехкоординатной тригональной пирамидальной геометрией, при этом три остатка гистидина и мостиковая молекула гидроксида образуют четыре лиганда на каждом ионе меди. Сравнивая восстановленное состояние (Cu(I)-Cu(I)) с нативным состоянием (Cu(II)-Cu(II)) фермента, ключевым отличием является расстояние между двумя медными центрами. В окисленном состоянии Cu(II)-Cu(II) расстояние Cu-Cu составляет 3,3 Å, тогда как в восстановленном состоянии Cu(I)-Cu(I) расстояние увеличивается до 4,4 Å. [1]

В то время как активный центр как тирозиназы, так и катехолоксидазы содержит димедный центр, вариации в соответствующей структуре каждого фермента приводят к различной активности. В катехолоксидазе боковая цепь фенилаланина (Phe261) находится над одним из медных центров и не позволяет субстрату координироваться с обоими ионами меди в активном центре. Это исключает бидентатный координационный комплекс, необходимый для дифенолятного гидроксилирования, характерного для тирозиназы, но отсутствующего в катехолоксидазе. [13] Более того, His109, связанный с одним из медных центров, также ковалентно связан с Cys192 через тиоэфирный мостик. [14] Эта цистеин-гистидиновая сшивка может дополнительно сдерживать активный центр фермента от принятия бидентатного координационного комплекса, легко образующегося в тирозиназе.

Каталитический цикл и механизм

Предложенный каталитический цикл катехолоксидазы, очищенной из Ipomoea batata .

Хотя кристаллическая структура катехолоксидазы была решена, вопросы, касающиеся точного механизма реакции, остаются. Один механизм, предложенный Эйкеном и др., основан на кристаллической структуре катехолоксидазы, очищенной из Ipomoea batatas . [11] Каталитический цикл начинается с катехолоксидазы в ее нативном окисленном состоянии Cu(II)-Cu(II) с координированным гидроксид-ионом, соединяющим два медных центра. Когда катехол входит в активный центр , протон отрывается от одного из спиртов. Катехол координируется с центром Cu(II) монодентатным образом, замещая один из координирующих остатков гистидина. Координированный гидроксид-ион отрывает другой протон от катехола, образуя воду, и катехол окисляется до о-хинона. Два полученных электрона восстанавливают оба медных центра до их состояния Cu(I)-Cu(I). Затем дикислород связывает один медный центр, вытесняя координированную молекулу воды, а другая молекула катехола связывается с другим медным центром, вытесняя другой остаток гистидина. Это образует комплекс, в котором один медный центр имеет тетрагональную плоскую координацию с His240, His244 и молекулой дикислорода. Другой медный центр сохраняет свою первоначальную тетрагональную пирамидальную геометрию с дикислородом, His88 и His118 в экваториальных положениях и His109 в аксиальном положении. [3] В этом состоянии активный центр фермента находится в тройном комплексе катехолоксидаза–O 2 2− –катехин. Два электрона переносятся от субстрата к дикислороду, после чего следует разрыв связи O–O. Вода высвобождается, и второй продукт о-хинона образуется вместе с восстановлением исходного состояния Cu(II)-Cu(II), чтобы завершить каталитический цикл. [15]

Этот предложенный каталитический цикл подтверждается экспериментальным наблюдением, что стехиометрические количества о-хинона образуются после добавления катехола к ферменту, даже когда дикислород отсутствует. [15] Более того, как окисленное состояние Cu(II)-Cu(II), так и восстановленное состояние Cu(I)-Cu(I) были двумя состояниями, идентифицированными кристаллической структурой Ipomoea batatas . Монодентатное связывание катехола с медным центром подтверждалось кристаллической структурой катехолоксидазы, связанной с ингибитором связанного субстрата-аналога фенилтиомочевиной , которая также связывается с медным центром монодентатным образом. [11] Однако одной из проблем с этим каталитическим циклом является то, что заряд активного центра изменяется во время каталитического цикла с +1 на +3. Это требует наличия близлежащих оснований, которые могут хранить протоны; Однако рентгеновская кристаллическая структура не указывает на присутствие каких-либо таких оснований, поскольку остатки гистидина координируются с медными центрами. [16] Были предложены другие каталитические циклы, выявленные с помощью расчетов DFT и кристаллических структур, которые поддерживают тот же заряд в активном центре на протяжении всего цикла и, таким образом, не требуют близлежащих оснований. [15] [16] Однако некоторые промежуточные продукты в предлагаемом цикле не согласуются с экспериментальными данными, такими как то, что стехиометрические количества о-хинона могут образовываться после добавления катехола в отсутствие кислорода. [16]

Экономическая и промышленная значимость

Окисление фенольных субстратов до соответствующих им хинонов является основной причиной потемнения фруктов и овощей во время созревания, обработки и переработки. [17] Ферментативное потемнение влияет на питательную ценность и внешний вид фруктов и продуктов. По оценкам, более половины потерь фруктов происходит в результате ферментативного потемнения, и тропические продукты особенно уязвимы для этой реакции. [6] Потеря питательных веществ может происходить из-за взаимодействия хинонов, образующихся при окислении дифенолов, с боковыми цепями незаменимых аминокислот, полученных из растительных белков. В частности, тиоловые и аминные функциональные группы на боковых цепях аминокислот очень восприимчивы к связыванию хинонов и алкилированию. [18] Ключевая роль катехолоксидазы в ферментативном потемнении делает ее общей целью для ингибирования. Хотя существует ряд ингибирующих стратегий, таких как высокотемпературная обработка (70-90 °C) для устранения каталитической активности катехолоксидазы, [6] популярной стратегией является снижение pH с помощью лимонной кислоты . Катехолоксидаза более каталитически активна в диапазоне pH 4-8 из-за координации остатков гистидина с каталитическими медными центрами. Использование кислот, таких как лимонная кислота, для снижения pH ниже этого оптимального диапазона уменьшает связывание фермента с медью его активного центра, поскольку протонирование остатков гистидина мешает их способности координироваться с медными центрами. [19]

Искусственные ферменты

Новые подходы к разработке искусственных ферментов на основе аминокислот или пептидов как характерных молекулярных фрагментов привели к значительному расширению области искусственных ферментов или имитаторов ферментов. Недавние результаты группы Роба Лискэмпа показали, что остатки гистидина с каркасом могут использоваться в качестве имитаторов определенных металлопротеинов и -ферментов. Была показана структурная мимикрия некоторых медных белков (например, гемоцианина , тирозиназы и катехолоксидазы), содержащих участки связывания меди типа 3. Это значительное улучшение, поскольку использование остатков гистидина с каркасом на один шаг ближе к мимикрии ферментов биологически значимыми видами. [20]

Ссылки

  1. ^ ab Gerdemann C, Eicken C, Krebs B (март 2002 г.). «Кристаллическая структура катехолоксидазы: новый взгляд на функцию медных белков типа 3». Accounts of Chemical Research . 35 (3): 183–91. doi :10.1021/ar990019a. PMID  11900522.
  2. ^ Halder J, Tamuli P, Bhaduri A (1998). «Выделение и характеристика полифенолоксидазы из листьев индийского чая (Camellia sinensis)». Журнал пищевой биохимии . 9 (2): 75–80. doi :10.1016/s0955-2863(97)00170-8.
  3. ^ ab Koval IA, Gamez P, Belle C, Selmeczi K, Reedijk J (сентябрь 2006 г.). «Синтетические модели активного центра катехолоксидазы: механистические исследования». Chemical Society Reviews . 35 (9): 814–40. doi :10.1039/b516250p. PMID  16936929.
  4. ^ Дей СК, Мукерджи А (2016). «Катехиноксидаза и феноксазинонсинтаза: биомиметические функциональные модели и механистические исследования». Coordination Chemistry Reviews . 310 : 80–115. doi :10.1016/j.ccr.2015.11.002.
  5. ^ Гердеманн С, Эйкен С, Магрини А, Мейер Х.Э., Ромпель А, Спенер Ф, Кребс Б (июль 2001 г.). «Изозимы катехолоксидазы Ipomoea batatas отличаются каталазоподобной активностью». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) - Структура белка и молекулярная энзимология . 1548 (1): 94–105. дои : 10.1016/s0167-4838(01)00219-9. ПМИД  11451442.
  6. ^ abc Кейруш С., Лопес М.Л., Фиальо Э., Валенте-Мескита В.Л. (2008). «Полифенолоксидаза: характеристики и механизмы контроля потемнения». Food Reviews International . 24 (4): 361–375. дои : 10.1080/87559120802089332.
  7. ^ Marusek CM, Trobaugh NM, Flurkey WH, Inlow JK (январь 2006 г.). «Сравнительный анализ полифенолоксидазы из растений и грибковых видов». Журнал неорганической биохимии . 100 (1): 108–23. doi :10.1016/j.jinorgbio.2005.10.008. PMID  16332393.
  8. ^ Sommer A, Ne'eman E, Steffens JC, Mayer AM, Harel E (август 1994). «Импорт, нацеливание и обработка растительной полифенолоксидазы». Физиология растений . 105 (4): 1301–11. doi :10.1104/pp.105.4.1301. PMC 159463. PMID  7972497 . 
  9. ^ Mayer AM (ноябрь 2006 г.). «Полифенолоксидазы в растениях и грибах: куда идут? Обзор». Фитохимия . 67 (21): 2318–31. doi :10.1016/j.phytochem.2006.08.006. PMID  16973188.
  10. ^ Flurkey WH, Inlow JK (декабрь 2008 г.). «Протеолитическая обработка полифенолоксидазы из растений и грибов». Журнал неорганической биохимии . 102 (12): 2160–70. doi :10.1016/j.jinorgbio.2008.08.007. PMID  18829115.
  11. ^ abc Eicken C, Krebs B, Sacchettini JC (декабрь 1999 г.). "Катехиноксидаза - структура и активность". Current Opinion in Structural Biology . 9 (6): 677–83. doi :10.1016/s0959-440x(99)00029-9. PMID  10607672.
  12. ^ Klabunde T, Eicken C, Sacchettini JC, Krebs B (декабрь 1998 г.). «Кристаллическая структура растительной катехолоксидазы, содержащей димедный центр». Nature Structural Biology . 5 (12): 1084–90. doi :10.1038/4193. PMID  9846879.
  13. ^ Lucas HR, Karlin KD (2009). "Глава 9: Связи медь-углерод в механистическом и структурном исследовании белков, а также в ситуациях, когда медь является каталитическим или рецепторным сайтом". В Sigel A, Sigel H, Sigel RK (ред.). Связи металл-углерод в ферментах и ​​кофакторах . Кембридж, Великобритания: RSC Publishing. стр. 304. ISBN 978-1-84755-915-9.
  14. ^ Virador VM, Reyes Grajeda JP, Blanco-Labra A, Mendiola-Olaya E, Smith GM, Moreno A, Whitaker JR (январь 2010 г.). «Клонирование, секвенирование, очистка и кристаллическая структура полифенолоксидазы Гренаша (Vitis vinifera)». Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии . 58 (2): 1189–201. doi :10.1021/jf902939q. PMID  20039636.
  15. ^ abc Siegbahn PE (июль 2004 г.). «Каталитический цикл катехолоксидазы». Журнал биологической неорганической химии . 9 (5): 577–90. doi :10.1007/s00775-004-0551-2. PMID  15185133.
  16. ^ abc Güell M, Siegbahn PE (ноябрь 2007 г.). «Теоретическое исследование каталитического механизма катехолоксидазы». Журнал биологической неорганической химии . 12 (8): 1251–64. doi :10.1007/s00775-007-0293-z. PMID  17891425.
  17. ^ Мартинес М., Уитакер Дж. Р. (июнь 1995 г.). «Биохимия и контроль ферментативного потемнения». Тенденции в пищевой науке и технологии . 6 (6): 195–200. doi :10.1016/S0924-2244(00)89054-8.
  18. ^ Mathesis G, Whitaker JR (сентябрь 1984 г.). «Модификация белков полифенолоксидазой и пероксидазой и их продуктами». Журнал пищевой биохимии . 8 (3): 137–162. doi :10.1111/j.1745-4514.1984.tb00322.x.
  19. ^ Yoruk R, Marshall MR (ноябрь 2003 г.). «Физико-химические свойства и функции растительной полифенолоксидазы: обзор». Журнал пищевой биохимии . 27 (5): 361–422. doi :10.1111/j.1745-4514.2003.tb00289.x.
  20. ^ Albada HB, Soulimani F, Weckhuysen BM , Liskamp RM (декабрь 2007 г.). «Каркасные аминокислоты как близкий структурный имитатор участков связывания меди типа 3». Chemical Communications (46): 4895–7. doi :10.1039/B709400K. PMID  18361361.

Внешние ссылки