В молекулярной биологии количественное определение нуклеиновых кислот обычно выполняется для определения средних концентраций ДНК или РНК, присутствующих в смеси, а также их чистоты. Реакции, в которых используются нуклеиновые кислоты, часто требуют определенных количеств и чистоты для оптимальной производительности. На сегодняшний день существует два основных подхода, используемых учеными для количественного определения или установления концентрации нуклеиновых кислот (таких как ДНК или РНК) в растворе. Это спектрофотометрическое количественное определение и УФ-флуоресцентное мечение в присутствии красителя ДНК. [ необходима цитата ]
Одним из наиболее часто используемых методов количественной оценки ДНК или РНК является применение спектрофотометрического анализа с использованием спектрофотометра . [1] Спектрофотометр способен определять средние концентрации нуклеиновых кислот ДНК или РНК, присутствующих в смеси, а также их чистоту.
Спектрофотометрический анализ основан на принципах, согласно которым нуклеиновые кислоты поглощают ультрафиолетовый свет определенным образом. В случае ДНК и РНК образец подвергается воздействию ультрафиолетового света с длиной волны 260 нанометров (нм), а фотодетектор измеряет свет, проходящий через образец. Часть ультрафиолетового света пройдет, а часть будет поглощена ДНК/РНК. Чем больше света поглощается образцом, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце. В результате на фотодетектор попадет меньше света, и это приведет к более высокой оптической плотности (ОП).
Используя закон Бера-Ламберта , можно связать количество поглощенного света с концентрацией поглощающей молекулы. При длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двухцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл) −1 см −1 , для одноцепочечной ДНК — 0,027 (мкг/мл) −1 см −1 , для одноцепочечной РНК — 0,025 (мкг/мл) −1 см −1 , а для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов он зависит от длины и состава оснований. Таким образом, поглощение (A), равное 1, соответствует концентрации 50 мкг/мл для двухцепочечной ДНК. Этот метод расчета действителен до A не менее 2. [2] Для олигонуклеотидов может потребоваться более точный коэффициент экстинкции; их можно предсказать с помощью модели ближайшего соседа. [3]
Оптическая плотность [4] рассчитывается по уравнению:
На практике образец, не содержащий ДНК или РНК, не должен
поглощать ультрафиолетовый свет и, следовательно, давать OD 0.
Оптическая плотность = Log (100/100)=0
При использовании спектрофотометрического анализа для определения концентрации ДНК или РНК закон Ламберта-Бера используется для определения неизвестных концентраций без необходимости использования стандартных кривых. По сути, закон Ламберта-Бера позволяет связать количество поглощенного света с концентрацией поглощающей молекулы. Для преобразования OD в концентрацию неизвестных образцов нуклеиновых кислот используются следующие коэффициенты преобразования единиц поглощения в концентрацию нуклеиновых кислот: [5]
При использовании длины пути 10 мм просто умножьте OD на коэффициент пересчета , чтобы определить концентрацию. Например, образец dsDNA с OD 2,0 соответствует образцу с концентрацией 100 мкг/мл.
При использовании длины пути короче 10 мм результирующая OD будет уменьшена в 10 раз/длина пути. Используя пример выше с длиной пути 3 мм, OD для образца 100 мкг/мл будет уменьшена до 0,6. Чтобы нормализовать концентрацию до эквивалента 10 мм, делается следующее:
0,6 OD X (10/3) * 50 мкг/мл=100 мкг/мл
Большинство спектрофотометров позволяют выбирать тип нуклеиновой кислоты и длину пути таким образом, чтобы результирующая концентрация была нормализована к длине пути 10 мм, что основано на принципах закона Бера .
«Единица A260» используется в качестве количественной меры для нуклеиновых кислот. Одна единица A260 — это количество нуклеиновой кислоты, содержащейся в 1 мл и дающей OD 1. Применяются те же коэффициенты пересчета, и поэтому в таких контекстах:
Образцы нуклеиновых кислот часто загрязнены другими молекулами (т. е. белками, органическими соединениями и т. д.). Вторичным преимуществом использования спектрофотометрического анализа для количественной оценки нуклеиновых кислот является возможность определения чистоты образца с использованием расчета 260 нм:280 нм. Соотношение поглощения при 260 и 280 нм (A 260/280 ) используется для оценки чистоты нуклеиновых кислот. Для чистой ДНК A 260/280 широко считается равным ~1,8, но утверждается, что из-за числовых ошибок в оригинальной статье Варбурга его можно перевести в смесь 60% белка и 40% ДНК. [6] Соотношение для чистой РНК A 260/280 составляет ~2,0. Эти соотношения обычно используются для оценки количества белкового загрязнения, оставшегося после процесса выделения нуклеиновой кислоты, поскольку белки поглощают при 280 нм.
Соотношение поглощения при 260 нм и 280 нм обычно используется для оценки загрязнения ДНК белковых растворов, поскольку белки (в частности, ароматические аминокислоты) поглощают свет при 280 нм. [2] [7] Обратное, однако, неверно — требуется относительно большое количество белкового загрязнения, чтобы существенно повлиять на соотношение 260:280 в растворе нуклеиновой кислоты. [2] [6]
Соотношение 260:280 имеет высокую чувствительность к загрязнению нуклеиновыми кислотами белка:
Соотношение 260:280 не обеспечивает чувствительности к загрязнению протеинами нуклеиновых кислот (таблица показана для РНК, 100% ДНК составляет приблизительно 1,8):
Это различие обусловлено гораздо более высоким коэффициентом затухания массы нуклеиновых кислот при 260 нм и 280 нм по сравнению с таковым у белков. Из-за этого, даже при относительно высоких концентрациях белка, белок вносит относительно небольшой вклад в поглощение 260 и 280. Хотя загрязнение белка нельзя надежно оценить с помощью соотношения 260:280, это также означает, что оно вносит небольшую ошибку в оценку количества ДНК.
Изучение спектров образцов может быть полезным для выявления проблем с чистотой образцов.
Альтернативным методом оценки концентрации ДНК и РНК является маркировка образца флуоресцентной меткой , которая представляет собой флуоресцентный краситель, используемый для измерения интенсивности красителей , которые связываются с нуклеиновыми кислотами и селективно флуоресцируют при связывании (например, бромистый этидий ). Этот метод полезен в случаях, когда концентрация слишком мала для точной оценки с помощью спектрофотометрии, и в случаях, когда загрязняющие вещества, поглощающие при 260 нм, делают точную количественную оценку этим методом невозможной. Преимуществом флуоресцентной количественной оценки ДНК и РНК является улучшенная чувствительность по сравнению со спектрофотометрическим анализом . Хотя это повышение чувствительности достигается за счет более высокой цены за образец и более длительного процесса подготовки образца .
Существует два основных способа подхода к этому. «Пятнистый» метод заключается в размещении образца непосредственно на агарозном геле или пластиковой пленке . Флуоресцентный краситель либо присутствует в агарозном геле, либо добавляется в соответствующих концентрациях к образцам на пластиковой пленке. Набор образцов с известными концентрациями наносится рядом с образцом. Затем концентрация неизвестного образца оценивается путем сравнения с флуоресценцией этих известных концентраций. В качестве альтернативы можно пропустить образец через агарозный или полиакриламидный гель вместе с некоторыми образцами известной концентрации. Как и в случае с точечным тестом, концентрация оценивается путем сравнения интенсивности флуоресценции с известными образцами. [2]
Если объемы образцов достаточно велики для использования микропланшетов или кювет , образцы, загруженные красителем, также можно количественно определить с помощью флуоресцентного фотометра . Минимальный объем образца начинается с 0,3 мкл. [10]
На сегодняшний день не существует флуоресцентного метода определения белкового загрязнения образца ДНК, аналогичного спектрофотометрическому методу 260 нм/280 нм.