stringtranslate.com

Комплементарная ДНК

Выходные данные микрочипа кДНК , использованного при тестировании

В генетике комплементарная ДНК ( кДНК ) — это ДНК , которая была обратно транскрибирована (с помощью обратной транскриптазы ) с РНК (например, информационной РНК или микроРНК ). кДНК существует как в одноцепочечной , так и в двухцепочечной форме, как в естественной, так и в искусственно созданной форме.

В сконструированных формах это часто копия (реплика) естественно встречающейся ДНК из естественного генома любого конкретного организма; собственная мРНК организма была естественным образом транскрибирована с его ДНК, а кДНК подвергается обратной транскрипции с мРНК, в результате чего получается дубликат исходной ДНК. Сконструированная кДНК часто используется для экспрессии определенного белка в клетке, которая обычно не экспрессирует этот белок (т. е. гетерологичная экспрессия), или для секвенирования или количественной оценки молекул мРНК с использованием методов на основе ДНК (кПЦР, РНК-секвенирование). кДНК, которая кодирует определенный белок, может быть перенесена в клетку-реципиент для экспрессии в качестве части рекомбинантной ДНК , часто бактериальных или дрожжевых систем экспрессии. [1] кДНК также генерируется для анализа транскриптомных профилей в объемной ткани, отдельных клетках или отдельных ядрах в таких анализах, как микрочипы , кПЦР и РНК-секвенирование .

В естественных формах кДНК продуцируется ретровирусами (такими как ВИЧ-1 , ВИЧ-2 , вирус иммунодефицита обезьян и т. д.), а затем интегрируется в геном хозяина, где она создает провирус . [2]

Термин кДНК также используется, как правило, в контексте биоинформатики , для обозначения последовательности транскрипта мРНК, выраженной в виде оснований ДНК (дезокси-GCAT), а не оснований РНК (GCAU).

Патентоспособность кДНК стала предметом решения Верховного суда США 2013 года по делу Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics, Inc. В качестве компромисса суд постановил, что кДНК, содержащая только экзоны, подлежит патентованию, тогда как изолированные последовательности встречающейся в природе ДНК, включающие интроны , не подлежат патентованию.

Синтез

РНК служит шаблоном для синтеза кДНК. [3] В клеточной жизни кДНК генерируется вирусами и ретротранспозонами для интеграции РНК в целевую геномную ДНК . В молекулярной биологии РНК очищается от исходного материала после удаления геномной ДНК, белков и других клеточных компонентов. Затем кДНК синтезируется посредством обратной транскрипции in vitro . [4]

очистка РНК

РНК транскрибируется из геномной ДНК в клетках-хозяевах и извлекается путем лизиса клеток, а затем очистки РНК с использованием широко используемых методов, таких как фенол-хлороформ, колонка с силикагелем и методы извлечения РНК на основе бусинок. [5] Методы извлечения различаются в зависимости от исходного материала. Например, извлечение РНК из растительной ткани требует дополнительных реагентов, таких как поливинилпирролидон (ПВП), для удаления фенольных соединений, углеводов и других соединений, которые в противном случае сделают РНК непригодной для использования. [6] Для удаления ДНК и белков для деградации используются ферменты, такие как ДНКаза и протеиназа К. [7] Важно, что целостность РНК поддерживается путем инактивации РНКаз хаотропными агентами, такими как изотиоцианат гуанидиния, додецилсульфат натрия (SDS), фенол или хлороформ. Затем общая РНК отделяется от других клеточных компонентов и осаждается спиртом. Существуют различные коммерческие наборы для простого и быстрого извлечения РНК для конкретных применений. [8] Дополнительные методы, основанные на использовании гранул, могут быть использованы для выделения определенных подтипов РНК (например, мРНК и микроРНК ) на основе размера или уникальных участков РНК. [9] [10]

Обратная транскрипция

Синтез первой цепи

Используя фермент обратной транскриптазы и очищенные шаблоны РНК, получают одну цепь кДНК (синтез первой цепи кДНК). Обратная транскриптаза M-MLV из вируса лейкемии мышей Молони обычно используется из-за ее сниженной активности РНКазы H, подходящей для транскрипции более длинных РНК. [11] Обратная транскриптаза AMV из вируса миелобластоза птиц также может использоваться для матриц РНК с прочными вторичными структурами (т. е. высокой температурой плавления). [12] кДНК обычно генерируется из мРНК для анализов экспрессии генов, таких как ОТ-кПЦР и РНК-секвенирование . [13] мРНК селективно обратно транскрибируется с использованием праймеров олиго-dT , которые являются обратным комплементом полиаденилированного хвоста на 3'-конце всех мРНК. Праймер олиго-dT отжигается с полиаденилированным хвостом мРНК, чтобы служить сайтом связывания для обратной транскриптазы, чтобы начать обратную транскрипцию. Оптимизированная смесь олиго-dT и случайных гексамерных праймеров увеличивает вероятность получения полноразмерной кДНК, одновременно уменьшая смещение 5' или 3'. [14] Рибосомальная РНК также может быть истощена для обогащения как мРНК, так и неполиаденилированных транскриптов, таких как некоторые некодирующие РНК . [15]

Синтез второй цепи

Результат синтеза первой цепи, гибриды РНК-ДНК, можно обрабатывать с помощью нескольких методов синтеза второй цепи или обрабатывать напрямую в последующих анализах. [16] [17] Ранний метод, известный как синтез с праймированием шпилькой, основывался на образовании шпильки на 3'-конце кДНК первой цепи для запуска синтеза второй цепи. Однако праймирование является случайным, а гидролиз шпильки приводит к потере информации. Процедура Гублера и Хоффмана использует РНКазу H E. Coli для надреза мРНК, которая заменяется ДНК-полимеразой I E. Coli и запечатывается ДНК-лигазой E. Coli . Оптимизация этой процедуры основана на низкой активности РНКазы H M-MLV для надреза мРНК, а оставшаяся РНК впоследствии удаляется путем добавления РНКазы H после трансляции ДНК-полимеразой кДНК второй цепи. Это предотвращает потерю информации о последовательности на 5'-конце мРНК.

Приложения

Комплементарная ДНК часто используется при клонировании генов или в качестве генных зондов или при создании библиотеки кДНК . Когда ученые переносят ген из одной клетки в другую, чтобы экспрессировать новый генетический материал в виде белка в клетке-реципиенте, кДНК будет добавлена ​​к реципиенту (а не ко всему гену), поскольку ДНК для всего гена может включать ДНК, которая не кодирует белок или которая прерывает кодирующую последовательность белка (например, интроны ). Частичные последовательности кДНК часто получают в виде экспрессируемых меток последовательности .

С амплификацией последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая теперь является обычным явлением, обычно проводят обратную транскрипцию в качестве начального шага, за которым следует ПЦР для получения точной последовательности кДНК для внутриклеточной экспрессии. Это достигается путем разработки специфических для последовательности ДНК-праймеров, которые гибридизуются с 5' и 3' концами области кДНК, кодирующей белок. После амплификации последовательность может быть разрезана на каждом конце нуклеазами и вставлена ​​в одну из многих небольших кольцевых последовательностей ДНК, известных как векторы экспрессии. Такие векторы допускают саморепликацию внутри клеток и потенциальную интеграцию в ДНК хозяина. Они, как правило, также содержат сильный промотор для управления транскрипцией целевой кДНК в мРНК, которая затем транслируется в белок.

cDNA также используется для изучения экспрессии генов с помощью таких методов, как RNA-seq или RT-qPCR . [18] [19] [20] Для секвенирования РНК должна быть фрагментирована из-за ограничений размера платформы секвенирования. Кроме того, синтезированная во второй цепи cDNA должна быть лигирована с адаптерами, которые позволяют фрагментам cDNA амплифицироваться с помощью ПЦР и связываться с ячейками потока секвенирования. Методы анализа, специфичные для генов, обычно используют микрочипы и RT-qPCR для количественной оценки уровней cDNA с помощью флуориметрических и других методов.

13 июня 2013 года Верховный суд США постановил в деле Ассоциации молекулярной патологии против Myriad Genetics , что, хотя естественные гены не могут быть запатентованы , кДНК может быть запатентована, поскольку она не встречается в природе. [21]

Вирусы и ретротранспозоны

Некоторые вирусы также используют кДНК для превращения своей вирусной РНК в мРНК (вирусная РНК → кДНК → мРНК). МРНК используется для создания вирусных белков, чтобы захватить клетку-хозяина.

Пример этого первого шага от вирусной РНК к кДНК можно увидеть в цикле заражения ВИЧ. Здесь мембрана клетки-хозяина прикрепляется к липидной оболочке вируса, что позволяет вирусному капсиду с двумя копиями вирусной геномной РНК проникнуть в хозяина. Затем копия кДНК создается посредством обратной транскрипции вирусной РНК, процесса, облегчаемого шапероном CypA и обратной транскриптазой, связанной с вирусным капсидом. [22]

кДНК также генерируется ретротранспозонами в эукариотических геномах. Ретротранспозоны — это мобильные генетические элементы, которые перемещаются внутри геномов, а иногда и между ними, посредством РНК-посредников. Этот механизм характерен и для вирусов, за исключением генерации инфекционных частиц. [23] [24]

Смотрите также

Ссылки

Марк Д. Адамс и др. «Комплементарное секвенирование ДНК: экспрессированные метки последовательностей и проект генома человека». Science (Американская ассоциация содействия развитию науки) 252.5013 (1991): 1651–1656. Web.

Филип М. Мерфи и Х. Ли Тиффани. «Клонирование комплементарной ДНК, кодирующей функциональный человеческий рецептор интерлейкина-8». Science (Американская ассоциация содействия развитию науки) 253.5025 (1991): 1280–1283. Web.

  1. ^ Hastings, PJ (1 января 2001 г.), «Комплементарная ДНК (кДНК)», в Brenner, Сидней; Miller, Jefferey H. (ред.), Encyclopedia of Genetics , Нью-Йорк: Academic Press, стр. 433, ISBN 978-0-12-227080-2, получено 29 ноября 2022 г.
  2. ^ Крой, Рон. «Молекулярная генетика II — курс генной инженерии (дополнительные примечания)». Университет Дарема durham.ac.uk; 20 апреля 1998 г. Архивировано из оригинала 24 августа 2002 г. Получено 4 февраля 2015 г.
  3. ^ Ин, Шао-Яо (1 июля 2004 г.). «Дополнительные библиотеки ДНК». Молекулярная биотехнология . 27 (3): 245–252. doi :10.1385/MB:27:3:245. ISSN  1559-0305. PMID  15247497. S2CID  25600775.
  4. ^ "5 шагов к оптимальному синтезу кДНК - США". www.thermofisher.com . Получено 12 мая 2020 г. .
  5. ^ Таварес, Луселия; Алвес, Паула М .; Феррейра, Рикардо Б.; Сантос, Клаудия Н. (6 января 2011 г.). «Сравнение различных методов выделения РНК без ДНК из нейробластомы SK-N-MC». Исследовательские заметки BMC . 4 (1): 3. дои : 10.1186/1756-0500-4-3 . ISSN  1756-0500. ПМК 3050700 . ПМИД  21211020. 
  6. ^ R, Kansal; K, Kuhar; I, Verma; Rn, Gupta; Vk, Gupta; Kr, Koundal (декабрь 2008 г.). «Улучшенный и удобный метод выделения РНК из полифенолов и тканей растений, богатых полисахаридами». Indian Journal of Experimental Biology . 46 (12): 842–5. PMID  19245182.
  7. ^ I, Vomelová; Z, Vanícková; A, Sedo (2009). «Методы очистки РНК. Все пути (должны) вести в Рим». Folia Biologica . 55 (6): 243–51. PMID  20163774.
  8. ^ Sellin Jeffries, Marlo K.; Kiss, Andor J.; Smith, Austin W.; Oris, James T. (14 ноября 2014 г.). «Сравнение коммерчески доступных автоматизированных и ручных наборов для экстракции для изоляции общей РНК из небольших образцов тканей». BMC Biotechnology . 14 (1): 94. doi : 10.1186/s12896-014-0094-8 . ISSN  1472-6750. PMC 4239376 . PMID  25394494. 
  9. ^ "Изоляция мРНК с помощью Dynabeads за 15 минут - США". www.thermofisher.com . Получено 20 мая 2020 г. .
  10. ^ Gaarz, Andrea; Debey-Pascher, Svenja; Classen, Sabine; Eggle, Daniela; Gathof, Birgit; Chen, Jing; Fan, Jian-Bing; Voss, Thorsten; Schultze, Joachim L.; Staratschek-Jox, Andrea (май 2010 г.). «Профилирование экспрессии микроРНК в периферической крови на основе массива бусин и влияние различных подходов к изоляции РНК». Журнал молекулярной диагностики . 12 (3): 335–344. doi :10.2353/jmoldx.2010.090116. ISSN  1525-1578. PMC 2860470. PMID 20228267  . 
  11. ^ Хаддад, Фадиа; Болдуин, Кеннет М. (2010), Кинг, Никола (ред.), «Обратная транскрипция рибонуклеиновой кислоты: первый шаг в анализе ОТ-ПЦР», Протоколы ОТ-ПЦР: второе издание , Методы в молекулярной биологии, т. 630, Humana Press, стр. 261–270, doi :10.1007/978-1-60761-629-0_17, ISBN 978-1-60761-629-0, PMID  20301003
  12. ^ Мартин, Карен. «Обзор и применение обратной транскриптазы и кДНК». Gold Biotechnology . Получено 20 мая 2020 г.
  13. ^ "qPCR, Microarrays или РНК-секвенирование — что выбрать?". BioSistemika . 10 августа 2017 г. Получено 20 мая 2020 г.
  14. ^ "cDNA Synthesis | Bio-Rad". www.bio-rad.com . Получено 28 мая 2020 г. .
  15. ^ Herbert, Zachary T.; Kershner, Jamie P.; Butty, Vincent L.; Thimmapuram, Jyothi; Choudhari, Sulbha; Alekseyev, Yuriy O.; Fan, Jun; Podnar, Jessica W.; Wilcox, Edward; Gipson, Jenny; Gillaspy, Allison (15 марта 2018 г.). "Cross-site comparison of ribosomal depletion kits for Illumina RNAseq library construction". BMC Genomics . 19 (1): 199. doi : 10.1186/s12864-018-4585-1 . ISSN  1471-2164. PMC 6389247 . PMID  29703133. 
  16. ^ Invitrogen. "cDNA Synthesis System" (PDF) . Thermofisher . Архивировано (PDF) из оригинала 22 декабря 2018 г. . Получено 27 мая 2020 г. .
  17. ^ Агарвал, Саурабх; Макфарлан, Тодд С.; Сартор, Морин А.; Ивасе, Шигеки (21 января 2015 г.). «Секвенирование библиотеки первой цепи ДНК выявляет полноразмерные транскриптомы». Nature Communications . 6 (1): 6002. Bibcode :2015NatCo...6.6002A. doi :10.1038/ncomms7002. ISSN  2041-1723. PMC 5054741 . PMID  25607527. 
  18. ^ Derisi, J.; Penland, L.; Brown, PO; Bittner, ML; Meltzer, PS; Ray, M.; Chen, Y.; Su, YA; Trent, JM (декабрь 1996 г.). «Использование микрочипа кДНК для анализа паттернов экспрессии генов при раке человека». Nature Genetics . 14 (4): 457–460. doi :10.1038/ng1296-457. ISSN  1546-1718. PMID  8944026. S2CID  23091561.
  19. ^ Уайт, Адам К.; ВанИнсберг, Майкл; Петрив, Олег И.; Хамиди, Мани; Сикорский, Дарек; Марра, Марко А.; Пирет, Джеймс; Апарисио, Сэмюэл; Хансен, Карл Л. (23 августа 2011 г.). «Высокопроизводительная микрофлюидная ОТ-ПЦР с одной ячейкой». Труды Национальной академии наук . 108 (34): 13999–14004. Bibcode : 2011PNAS..10813999W. doi : 10.1073/pnas.1019446108 . ISSN  0027-8424. PMC 3161570. PMID 21808033  . 
  20. ^ Hrdlickova, Radmila; Toloue, Masoud; Tian, ​​Bin (январь 2017 г.). «Методы РНК-Seq для анализа транскриптома». Wiley Interdisciplinary Reviews. РНК . 8 (1): e1364. doi :10.1002/wrna.1364. ISSN  1757-7004. PMC 5717752. PMID 27198714  . 
  21. ^ Липтак, Адам (13 июня 2013 г.). «Верховный суд постановил, что человеческие гены не могут быть запатентованы». The New York Times . Архивировано из оригинала 1 января 2022 г. Получено 14 июня 2013 г.
  22. ^ Альтфельд, Маркус; Гейл, Майкл-младший (1 июня 2015 г.). «Врожденный иммунитет против инфекции ВИЧ-1». Nature Immunology . 16 (6): 554–562. doi : 10.1038/ni.3157 . ISSN  1529-2908. PMID  25988887. S2CID  1577651.
  23. ^ Хавекер, Эрика Р.; Гао, Сян; Войтас, Дэниел Ф. (18 мая 2004 г.). «Разнообразие ретротранспозонов LTR». Genome Biology . 5 (6): 225. doi : 10.1186/gb-2004-5-6-225 . ISSN  1474-760X. PMC 463057. PMID 15186483  . 
  24. ^ Cordaux, Richard; Batzer, Mark A. (октябрь 2009 г.). «Влияние ретротранспозонов на эволюцию генома человека». Nature Reviews Genetics . 10 (10): 691–703. doi :10.1038/nrg2640. ISSN  1471-0064. PMC 2884099. PMID 19763152  . 

Внешние ссылки