Микротом (от греческого mikros , что означает «маленький», и temnein , что означает «резать») — режущий инструмент, используемый для получения очень тонких срезов материала, известных как секции , при этом процесс называется микросекционированием . Важно в науке , микротомы используются в микроскопии для подготовки образцов для наблюдения в проходящем свете или электронном излучении.
Микротомы используют стальные , стеклянные или алмазные лезвия в зависимости от разрезаемого образца и желаемой толщины разрезаемых срезов. Стальные лезвия используются для подготовки гистологических срезов тканей животных или растений для световой микроскопии . Стеклянные ножи используются для разрезания срезов для световой микроскопии и для разрезания очень тонких срезов для электронной микроскопии . Алмазные ножи промышленного класса используются для разрезания твердых материалов, таких как кости , зубы и жесткие растительные вещества, как для световой, так и для электронной микроскопии. Алмазные ножи ювелирного качества также используются для разрезания тонких срезов для электронной микроскопии.
Микротомия — это метод подготовки тонких срезов таких материалов, как кости, минералы и зубы, а также альтернатива электрополировке и ионному фрезерованию . Микротомные срезы можно сделать достаточно тонкими, чтобы разрезать человеческий волос поперек, с толщиной среза от 50 нм до 100 мкм .
На заре развития светового микроскопа срезы растений и животных готовились вручную с помощью бритвенных лезвий. Было обнаружено, что для наблюдения за структурой исследуемого образца важно делать чистые воспроизводимые срезы порядка 100 мкм, через которые может проходить свет. Это позволило наблюдать образцы с помощью световых микроскопов в режиме пропускания.
Одно из первых устройств для подготовки таких срезов было изобретено в 1770 году Джорджем Адамсом-младшим (1750–1795) и далее усовершенствовано Александром Каммингсом . [2] Устройство управлялось вручную, образец удерживался в цилиндре, а секции создавались из верхней части образца с помощью рукоятки. [1] [3]
В 1835 году Эндрю Причард разработал модель на основе стола, которая позволяла изолировать вибрацию, прикрепив устройство к столу, отделив оператора от ножа. [4]
Иногда изобретение микротома приписывают анатому Вильгельму Гису-старшему (1865). [5] [6] В своем труде Beschreibung eines Mikrotoms ( описание микротома по-немецки ) Вильгельм писал:
Аппарат дал мне возможность точности в работе, с помощью которой я могу получать сечения, которые вручную я не смогу создать. А именно, он дал возможность получать целые сечения объектов в ходе исследования.
Другие источники также приписывают разработку чешскому физиологу Яну Эвангелисте Пуркине . [7] Несколько источников описывают модель Пуркине как первую в практическом применении. [8] [9]
Неясность происхождения микротома обусловлена тем фактом, что первые микротомы были просто режущими аппаратами, а этап разработки ранних устройств практически не документирован.
В конце 1800-х годов разработка очень тонких и постоянно тонких образцов с помощью микротомии, а также селективное окрашивание важных компонентов клеток или молекул, позволили визуализировать детали микроскопа. [10] [11]
Сегодня большинство микротомов представляют собой конструкцию ножевого блока со сменным ножом, держателем образца и механизмом продвижения. В большинстве устройств резка образца начинается с перемещения образца по ножу, где механизм продвижения автоматически перемещается вперед, так что можно сделать следующий разрез для выбранной толщины. Толщина среза контролируется механизмом регулировки, что позволяет осуществлять точный контроль.
Наиболее распространенные области применения микротомов :
Последней разработкой является лазерный микротом , который режет целевой образец фемтосекундным лазером вместо механического ножа. Этот метод является бесконтактным и не требует методов подготовки образца. Лазерный микротом способен нарезать практически любую ткань в ее естественном состоянии. В зависимости от обрабатываемого материала возможна толщина среза от 10 до 100 мкм.
Интервалы секционирования можно в основном классифицировать следующим образом:
Микротом с санями — это устройство, в котором образец помещается в фиксированный держатель (челнок), который затем движется вперед и назад по ножу. Современные микротомы с санями имеют салазки, размещенные на линейном подшипнике, конструкция, которая позволяет микротому легко разрезать множество грубых срезов. [13] Регулируя углы между образцом и ножом микротома, можно уменьшить давление, оказываемое на образец во время разреза. [13] Типичные области применения этой конструкции микротома — подготовка больших образцов, таких как образцы, залитые в парафин для биологических препаратов. Типичная толщина среза, достижимая на микротоме с санями, составляет от 1 до 60 мкм.
Этот инструмент представляет собой обычную конструкцию микротома. Это устройство работает с поэтапным вращательным действием, так что фактическое резание является частью вращательного движения. В роторном микротоме нож обычно фиксируется в вертикальном положении. [14]
На рисунке слева поясняется принцип разреза. Благодаря движению держателя образца образец разрезается ножом из положения 1 в положение 2, в этот момент свежий участок остается на ноже. В наивысшей точке вращательного движения держатель образца продвигается на ту же толщину, что и разрез, который должен быть сделан, что позволяет сделать следующий разрез.
Маховиком во многих микротомах можно управлять вручную. Это имеет то преимущество, что можно сделать чистый срез, так как относительно большая масса маховика предотвращает остановку образца во время резки. Маховик в новых моделях часто встроен в корпус микротома. Типичная толщина среза для роторного микротома составляет от 1 до 60 мкм. Для твердых материалов, таких как образец, залитый в синтетическую смолу, эта конструкция микротома может позволить делать хорошие «полутонкие» срезы толщиной всего 0,5 мкм.
Для резки замороженных образцов многие роторные микротомы могут быть адаптированы для резки в камере с жидким азотом, в так называемой установке криомикротома. Пониженная температура позволяет увеличить твердость образца, например, путем прохождения стеклования, что позволяет готовить полутонкие образцы. [13] Однако температура образца и температура ножа должны контролироваться, чтобы оптимизировать результирующую толщину образца.
Ультрамикротом является основным инструментом ультрамикротомии . Он позволяет готовить чрезвычайно тонкие срезы, при этом устройство функционирует так же, как ротационный микротом, но с очень жесткими допусками на механическую конструкцию. В результате тщательной механической конструкции линейное тепловое расширение крепления используется для обеспечения очень точного контроля толщины. [13]
Эти чрезвычайно тонкие срезы важны для использования с просвечивающим электронным микроскопом (ПЭМ) и последовательной сканирующей электронной микроскопией с блоками (SBFSEM), а иногда также важны для светооптической микроскопии. [14] Типичная толщина этих срезов составляет от 40 до 100 нм для просвечивающей электронной микроскопии и часто от 30 до 50 нм для SBFSEM. Более толстые срезы толщиной до 500 нм также берутся для специализированных приложений ПЭМ или для обзорных срезов световой микроскопии, чтобы выбрать область для конечных тонких срезов. Алмазные ножи (предпочтительно) и стеклянные ножи используются с ультрамикротомами. Чтобы собрать срезы, их плавают на поверхности жидкости по мере разрезания и осторожно собирают на сетки, подходящие для просмотра образцов в ПЭМ. Толщину среза можно оценить по цветам интерференции тонкой пленки отраженного света, которые видны в результате чрезвычайно малой толщины образца. [15]
Вибрационный микротом работает, разрезая вибрирующим лезвием, что позволяет производить резку с меньшим давлением, чем это потребовалось бы для неподвижного лезвия. Вибрационный микротом обычно используется для сложных биологических образцов. [13] Толщина среза обычно составляет около 30–500 мкм для живой ткани и 10–500 мкм для фиксированной ткани. [16]
Микротом-пила предназначен специально для твердых материалов, таких как зубы или кости. Микротом этого типа имеет утопленную вращающуюся пилу, которая разрезает образец. Минимальная толщина реза составляет около 30 мкм и может быть сделана для сравнительно больших образцов. [13]
Лазерный микротом — это инструмент для бесконтактной нарезки. [17] Предварительная подготовка образца путем заливки, замораживания или химической фиксации не требуется , что сводит к минимуму артефакты от методов подготовки. В качестве альтернативы эта конструкция микротома может также использоваться для очень твердых материалов, таких как кости или зубы, а также для некоторых видов керамики. В зависимости от свойств материала образца достижимая толщина составляет от 10 до 100 мкм.
Устройство работает с использованием режущего действия инфракрасного лазера. Поскольку лазер испускает излучение в ближнем инфракрасном диапазоне, в этом режиме длины волны лазер может взаимодействовать с биологическими материалами. Благодаря острой фокусировке зонда внутри образца можно достичь фокусной точки очень высокой интенсивности, до ТВт /см2 . Благодаря нелинейному взаимодействию оптического проникновения в фокальной области вводится разделение материалов в процессе, известном как фоторазрушение. Ограничивая длительность лазерного импульса фемтосекундным диапазоном, энергия, расходуемая в целевой области, точно контролируется, тем самым ограничивая зону взаимодействия разреза менее чем микрометром. Вне этой зоны сверхкороткое время приложения луча вносит минимальное или нулевое тепловое повреждение в оставшуюся часть образца.
Лазерное излучение направляется на оптическую систему на основе быстрого сканирующего зеркала, что позволяет осуществлять трехмерное позиционирование пересечения луча, при этом позволяя лучу проходить в нужную интересующую область. Сочетание высокой мощности с высокой скоростью растра позволяет сканеру вырезать большие области образца за короткое время. В лазерном микротоме также возможна лазерная микродиссекция внутренних областей в тканях, клеточных структурах и других типах мелких объектов.
Выбор профиля лезвия микротомного ножа зависит от материала и подготовки образцов, а также от требований к конечному образцу (например, толщины и качества среза).
Как правило, ножи характеризуются профилем лезвия, которое подразделяется на плосковогнутое, клиновидное или долотообразное.
Плоские вогнутые ножи микротома чрезвычайно острые, но также очень нежные и поэтому используются только с очень мягкими образцами. [14] Ножи с клиновидным профилем несколько более стабильны и находят применение в умеренно твердых материалах, например, при резке эпоксидных или криогенных образцов. Наконец, профиль долота с его тупым краем повышает стабильность ножа, при этом требуя значительно больше силы для выполнения разреза.
Для ультрамикротомов требуются стеклянные и алмазные ножи, ширина реза лезвия составляет порядка нескольких миллиметров и, следовательно, значительно меньше, чем у классических ножей микротома. Стеклянные ножи обычно изготавливаются путем разлома стеклянных стержней с использованием специальных устройств для разлома «изготовителя ножей». Стеклянные ножи могут использоваться для начальной подготовки образцов, даже когда алмазные ножи могут использоваться для окончательного разрезания. Стеклянные ножи обычно имеют небольшие желоба, сделанные из пластиковой ленты, которые заполняются водой, чтобы образец мог плавать для последующего сбора. [13] Алмазные лезвия могут быть встроены в такой существующий желоб, что позволяет использовать тот же метод сбора.
Перед разрезанием микротомом биологические материалы обычно помещают в более жесткий фиксатор, в процессе, известном как заливка. Это достигается путем притока жидкого вещества вокруг образца, например, парафина (воска) или эпоксидной смолы, которая помещается в форму и затем затвердевает, образуя «блок», который легко режется.
Наклон — это угол контакта между вертикалью образца и лезвием ножа. Если лезвие ножа находится под прямым углом (наклон = 90), разрез выполняется напрямую с использованием режима, основанного на давлении, и поэтому силы пропорционально больше. Однако, если нож наклонен, относительное движение ножа становится все более параллельным движению образца, что позволяет производить разрезание. Такое поведение очень важно для больших или твердых образцов.
Наклон ножа — это угол между поверхностью ножа и образцом. Для оптимального результата этот угол должен быть выбран соответствующим образом. Оптимальный угол зависит от геометрии ножа, скорости резки и многих других параметров. Если угол отрегулирован до нуля, рез ножа часто может стать неравномерным, и для его сглаживания необходимо использовать новое положение ножа.
Если угол слишком большой, образец может сминаться, а нож может вызывать периодические изменения толщины в срезе. Дальнейшее увеличение угла до слишком большого может повредить само лезвие ножа.
