stringtranslate.com

Криофиксация

Криофиксация — это метод фиксации или стабилизации биологических материалов в качестве первого шага в подготовке образцов для электронной микроскопии и криоэлектронной микроскопии . [1] Типичные образцы для криофиксации включают небольшие образцы растительной или животной ткани , клеточные суспензии микроорганизмов или культивируемых клеток , суспензии вирусов или вирусных капсидов и образцы очищенных макромолекул , особенно белков . [2] [3]

Виды криофиксации: замораживание-высушивание, замораживание-замещение и замораживание-травление. [ необходима цитата ] [ необходима уточнение ]

Замораживание при погружении

Метод включает сверхбыстрое охлаждение небольших образцов тканей или клеток до температуры жидкого азота (−196 °C) или ниже, останавливая все движение и метаболическую активность и сохраняя внутреннюю структуру путем замораживания всех жидких фаз до твердого состояния. Обычно образец погружают в жидкий азот или в жидкий этан или жидкий пропан в контейнере, охлаждаемом жидким азотом. Конечная цель — заморозить образец так быстро (со скоростью от 10 4 до 10 6 К в секунду), чтобы кристаллы льда не смогли образоваться или не смогли вырасти достаточно большими, чтобы повредить ультраструктуру образца . Формирование образцов, содержащих образцы в аморфном льду, является « святым Граалем » биологической криомикроскопии. [ необходима цитата ]

На практике очень трудно достичь достаточно высоких скоростей охлаждения, чтобы получить аморфный лед в образцах толщиной более нескольких микрометров . Для этой цели погружение образца в жидкий азот при его температуре кипения (−196 °C) [4] не всегда достаточно быстро замораживает образец по нескольким причинам. Во-первых, жидкий азот быстро кипит вокруг образца, образуя пленку изолирующего N
2газ, который замедляет передачу тепла в криогенную жидкость, известный как эффект Лейденфроста . Скорость охлаждения можно улучшить, перекачивая жидкий азот с помощью роторного лопастного вакуумного насоса в течение нескольких десятков секунд перед погружением в него образца. Это снижает температуру жидкого азота ниже его точки кипения, так что когда образец погружается в него, он плотно обволакивает образец на короткий период времени и извлекает из него тепло более эффективно. Еще более быстрое охлаждение можно получить, погрузив образцы в жидкий пропан или этан (было обнаружено, что этан более эффективен) [5], охлажденные очень близко к их точкам плавления с помощью жидкого азота [6] или ударив образец о тщательно отполированные металлические поверхности, охлажденные жидким азотом, сделанные из меди или серебра . [7] Во-вторых, два свойства самой воды препятствуют быстрой криофиксации в крупных образцах. [8] Теплопроводность льда очень низкая по сравнению с теплопроводностью металлов , и вода выделяет скрытую теплоту плавления при замерзании, что препятствует быстрому охлаждению образцов толщиной более нескольких микрометров.

Заморозка под высоким давлением

Высокое давление помогает предотвратить образование крупных кристаллов льда. Самостоятельная быстрая заморозка под давлением (SPRF) может использовать множество различных криогенов и недавно была расхвалена как привлекательная и недорогая альтернатива заморозке под высоким давлением (HPF). [9] Холодный сжатый азот заменяет этанол при температуре около 123 К. Затем теплый этанол вытесняется замораживающим LN2 и, скорее всего, производит смесь этанола и азота, которая постепенно становится все холоднее и холоднее. [10]

Сублимационная сушка

Время сушки сокращается до 30% при правильной сублимационной сушке . [11]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Pilhofer, Martin; Ladinsky, Mark S.; McDowall, Alasdair W.; Jensen, Grant J. (2010). Бактериальный ТЭМ . Методы в клеточной биологии. Т. 96. С. 21–45. doi :10.1016/S0091-679X(10)96002-0. ISBN 9780123810076. ISSN  0091-679X. PMID  20869517.
  2. ^ Эхлин П. (1992). Низкотемпературная микроскопия и анализ . Нью-Йорк: Plenum Publishing Corporation.
  3. ^ Дубоше Дж., Адриан М., Чанг Дж.Дж., Хомо Дж.С., Лепо Дж., Макдауолл AW, Шульц П. (1988). «Криоэлектронная микроскопия витрифицированных образцов» (PDF) . Quarterly Reviews of Biophysics . 21 (2): 129–228. doi :10.1017/s0033583500004297. PMID  3043536. S2CID  2741633.
  4. ^ Battersby BJ, Sharp JC, Webb RI, Barnes GT (1994). «Витрификация водных суспензий из контролируемой среды для электронной микроскопии: улучшенное устройство для охлаждения погружением». Журнал микроскопии . 176 (2): 110–120. doi :10.1111/j.1365-2818.1994.tb03505.x. S2CID  95926972.
  5. ^ Райан, Кит П. (1992). «Криофиксация тканей для электронной микроскопии: обзор методов охлаждения погружением» (PDF) . Scan. Microsc . 6 (3): 715–743.
  6. ^ Bald WB (1984). «Относительная эффективность криогенных жидкостей, используемых при быстром охлаждении криогенных образцов». Журнал микроскопии . 134 (3): 261–270. doi :10.1111/j.1365-2818.1984.tb02519.x. S2CID  97233738.
  7. ^ Allison DP, Daw CS, Rorvik MC (1987). «Конструкция и работа простого и недорогого устройства для быстрой заморозки для электронной микроскопии». Журнал микроскопии . 147 (Pt 1): 103–108. doi :10.1111/j.1365-2818.1987.tb02822.x. PMID  3305955. S2CID  112876.
  8. ^ Bald WB (1987). Количественная криофиксация . Бристоль и Филадельфия: Адам Хильгер.
  9. ^ Leunissen Jan LM и Yi H. (2009). «Быстрое замораживание под давлением (SPRF): новый метод криофиксации для подготовки образцов в электронной микроскопии». J. Microsc . 235 (1): 25–35. doi :10.1111/j.1365-2818.2009.03178.x. PMID  19566624. S2CID  205342519. Архивировано из оригинала 05.01.2013.
  10. ^ Studer, D (сентябрь 1995 г.). «Витрификация суставного хряща путем замораживания под высоким давлением». Журнал микроскопии . 179 (3): 321–322. doi :10.1111/j.1365-2818.1995.tb03648.x. PMID  7473694. S2CID  32347571.
  11. ^ Silva, ACC; Schmidt, FC (2019-10-01). «Вакуумная заморозка экстракта кофе при различных условиях процесса». Food and Bioprocess Technology . 12 (10): 1683–1695. doi :10.1007/s11947-019-02314-x. ISSN  1935-5149. S2CID  201644501.