stringtranslate.com

Мегануклеаза

Мегануклеазы — это эндодезоксирибонуклеазы, характеризующиеся большим участком распознавания (двухцепочечные последовательности ДНК из 12–40 пар оснований); в результате этот участок обычно встречается только один раз в любом геноме . Например, последовательность из 18 пар оснований, распознаваемая мегануклеазой I-SceI, в среднем потребовала бы генома, в двадцать раз превышающего размер человеческого генома , чтобы быть найденной один раз случайно (хотя последовательности с одним несовпадением встречаются примерно три раза на геном человеческого размера). Поэтому мегануклеазы считаются наиболее специфичными естественными рестрикционными ферментами .

Среди мегануклеаз семейство самонаводящихся эндонуклеаз LAGLIDADG стало ценным инструментом для изучения геномов и генной инженерии за последние пятнадцать лет. Мегануклеазы — это «молекулярные ножницы ДНК », которые можно использовать для замены, устранения или модификации последовательностей высоконаправленным образом. Модифицируя их последовательность распознавания с помощью белковой инженерии, можно изменить целевую последовательность. Мегануклеазы используются для модификации всех типов геномов, будь то бактериальные, растительные или животные. Они открывают широкие возможности для инноваций, особенно в области здоровья человека, например, для устранения вирусного генетического материала или «ремонта» поврежденных генов с помощью генной терапии.

Две основные семьи

Мегануклеазы обнаружены во многих организмах – археях или архебактериях, бактериях, фагах , грибах, дрожжах , водорослях и некоторых растениях. Они могут экспрессироваться в различных компартментах клетки – ядре , митохондриях или хлоропластах . Было идентифицировано несколько сотен таких ферментов .

Мегануклеазы в основном представлены двумя основными семействами ферментов, которые в совокупности известны как хоминговые эндонуклеазы: интронные эндонуклеазы и интеиновые эндонуклеазы.

В природе эти белки кодируются мобильными генетическими элементами, интронами или интеинами . Интроны размножаются путем вмешательства в точное место в ДНК, где экспрессия мегануклеазы производит разрыв в комплементарном аллеле , свободном от интрона или интеина . Для интеинов и интронов группы I этот разрыв приводит к дублированию интрона или интеина в месте разрезания посредством гомологичной рекомбинационной репарации двухцепочечных разрывов ДНК.

Мы знаем относительно мало о фактическом предназначении мегануклеаз. Широко распространено мнение, что генетический материал, кодирующий мегануклеазы, функционирует как паразитический элемент, который использует механизмы репарации двухцепочечной ДНК в своих интересах как средство размножения и распространения, не повреждая генетический материал своего хозяина.

Хоминг-эндонуклеазы из семейства LAGLIDADG

Существует пять семейств или классов хоуминг-эндонуклеаз. [1] Наиболее распространенным и известным является семейство LAGLIDADG . Эндонуклеазы семейства LAGLIDADG в основном встречаются в митохондриях и хлоропластах эукариотических одноклеточных организмов.

Название этого семейства соответствует аминокислотной последовательности (или мотиву), которая встречается, более или менее консервативно, во всех белках этого семейства. Эти небольшие белки также известны своими компактными и плотно упакованными трехмерными структурами.

Наиболее изученные эндонуклеазы, которые наиболее широко используются в исследованиях и генной инженерии, включают I-SceI (обнаружена в митохондриях пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae ), I-CreI (из хлоропластов зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii ) и I-DmoI (из архебактерии Desulfurococcus mobilis ).

Наиболее известные эндонуклеазы LAGLIDADG являются гомодимерами (например, I-CreI, состоящий из двух копий одного и того же домена белка) или внутренне симметричными мономерами (I-SceI). Сайт связывания ДНК, содержащий каталитический домен , состоит из двух частей по обе стороны от точки разрезания. Полусвязывающие сайты могут быть чрезвычайно похожи и связываться с палиндромной или полупалиндромной последовательностью ДНК (I-CreI), или они могут быть непалиндромными (I-SceI).

Как инструменты для генной инженерии

Высокая специфичность мегануклеаз обеспечивает им высокую степень точности и гораздо более низкую токсичность для клеток, чем другие встречающиеся в природе рестриктазы. Мегануклеазы были идентифицированы в 1990-х годах, и последующая работа показала, что они являются особенно перспективными инструментами для генной инженерии и редактирования генов , поскольку они способны эффективно вызывать гомологичную рекомбинацию, [2] генерировать мутации, [3] и изменять рамки считывания. [4]

Однако генетические рекомбинации, индуцированные мегануклеазой, которые можно было бы осуществить, были ограничены репертуаром доступных мегануклеаз. Несмотря на существование сотен мегануклеаз в природе и тот факт, что каждая из них способна переносить незначительные изменения в своем сайте распознавания, вероятность обнаружения мегануклеазы, способной разрезать данный ген в желаемом месте, крайне мала. Несколько групп обратили свое внимание на разработку новых мегануклеаз, которые будут нацелены на желаемые сайты распознавания.

Наиболее продвинутые исследования и приложения касаются хоуминг-эндонуклеаз семейства LAGLIDADG.

Для создания индивидуальных мегануклеаз были использованы два основных подхода:

Эти два подхода можно объединить, чтобы увеличить возможность создания новых ферментов, сохраняя при этом высокую степень эффективности и специфичности. Ученые из Cellectis работают над редактированием генов с 1999 года и разработали коллекцию из более чем 20 000 доменов белков из гомодимерной мегануклеазы I-CreI, а также из других каркасов мегануклеаз. [11] Их можно объединить, чтобы сформировать функциональные химерные гетеродимеры индивидуального изготовления для исследовательских лабораторий и промышленных целей.

Precision Biosciences, другая биотехнологическая компания, разработала полностью рациональный процесс проектирования под названием Directed Nuclease Editor (DNE), который способен создавать сконструированные мегануклеазы, которые нацелены и изменяют указанное пользователем место в геноме. [12] В 2012 году исследователи из Bayer CropScience использовали DNE для включения последовательности гена в ДНК растений хлопка, нацеливая ее точно на заранее определенный участок. [13]

Дополнительные приложения

Одним из последних достижений в использовании мегануклеаз для генной инженерии является включение домена связывания ДНК из эффекторов, подобных активаторам транскрипции (TAL), в гибридные нуклеазы. Эти «megaTAL» сочетают простоту проектирования и высокую специфичность связывания ДНК эффектора TAL с высокой эффективностью расщепления мегануклеаз. [14] Кроме того, мегануклеазы были слиты с ферментами обработки концов ДНК, чтобы способствовать склонному к ошибкам негомологичному соединению концов [15] и увеличить частоту мутагенных событий в данном локусе. [16]

Вероятности

Как указано в первом абзаце, мегануклеаза с последовательностью из 18 пар оснований в среднем потребовала бы генома в двадцать раз большего размера, чем человеческий геном, чтобы быть найденной случайно; расчет такой: 4 18 /3x10 9 = 22,9. Однако очень похожие последовательности встречаются гораздо чаще, причем частота быстро увеличивается по мере увеличения допустимых несовпадений.

Например, последовательность, которая идентична во всех, кроме одной пары оснований, будет встречаться случайно один раз на каждые 4 17 /18x3x10 9 = 0,32 эквивалента человеческого генома в среднем, или три раза на геном человека. Последовательность, которая идентична во всех, кроме двух пар оснований, будет в среднем встречаться случайно один раз на каждые 4 16 /(18C2)x3x10 9 = 0,0094 эквивалента человеческого генома, или 107 раз на геном человека.

Это важно, поскольку ферменты не обладают идеальной дискриминацией; нуклеаза все равно будет иметь некоторую вероятность действия, даже если последовательность не совпадает идеально. Таким образом, активность нуклеазы в последовательности с одним несовпадением меньше, чем в случае отсутствия несовпадений, а активность еще меньше в случае двух несовпадений, но все еще не равна нулю. Исключение этих последовательностей, которые очень похожи, но не идентичны, по-прежнему является важной проблемой, которую необходимо преодолеть в генной инженерии.

Другие соображения

Метилирование ДНК и структура хроматина влияют на эффективность расщепления мегануклеазой. [17] [18] Поэтому для практического применения этих ферментов необходимо тщательное рассмотрение генетического и эпигенетического контекста целевой последовательности.

В декабре 2014 года USPTO выдало патент 8,921,332, охватывающий редактирование генома in vitro на основе мегануклеазы. [19] Этот патент был лицензирован исключительно для Cellectis. [20]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Стоддард, Барри Л. (2006). «Структура и функция самонаводящейся эндонуклеазы». Quarterly Reviews of Biophysics . 38 (1): 49–95. doi :10.1017/S0033583505004063. PMID  16336743. S2CID  27841011.
  2. ^ Эпинат, Жан-Шарль; Арну, Сильвен; Чеймс, Патрик; Роше, Паскаль; Дефонтен, Доминик; Пузин, Клеманс; Патен, Амели; Зангеллини, Александр; Пакес, Фредерик (1 июня 2003 г.). «Новая сконструированная мегануклеаза индуцирует гомологичную рекомбинацию в клетках дрожжей и млекопитающих». Исследования нуклеиновых кислот . 31 (11): 2952–2962. дои : 10.1093/nar/gkg375. ISSN  1362-4962. ПМК 156710 . ПМИД  12771221. 
  3. ^ Arnould, Sylvain; Perez, Christophe; Cabaniols, Jean-Pierre; Smith, Julianne; Gouble, Agnès; Grizot, Sylvestre; Epinat, Jean-Charles; Duclert, Aymeric; Duchateau, Philippe (2007-08-03). "Сконструированные производные I-CreI, расщепляющие последовательности гена XPC человека, могут вызывать высокоэффективную коррекцию генов в клетках млекопитающих". Journal of Molecular Biology . 371 (1): 49–65. doi :10.1016/j.jmb.2007.04.079. ISSN  0022-2836. PMID  17561112.
  4. ^ Chapdelaine, P.; Pichavant, C.; Rousseau, J.; Pâques, F.; Tremblay, JP (2010-07-01). «Мегануклеазы могут восстановить рамку считывания мутировавшего дистрофина». Gene Therapy . 17 (7): 846–858. doi : 10.1038/gt.2010.26 . ISSN  1476-5462. PMID  20393509.
  5. ^ Seligman, LM ; Chisholm, KM; Chevalier, BS; Chadsey, MS; Edwards, ST; Savage, JH; Veillet, AL (2002). «Мутации, изменяющие специфичность расщепления самонаводящейся эндонуклеазы». Nucleic Acids Research . 30 (17): 3870–9. doi :10.1093/nar/gkf495. PMC 137417. PMID  12202772 . 
  6. ^ Сассман, Джанго; Чедси, Мег; Фос, Стив; Энгель, Алекс; Бруэтт, Анна; Моннат, Рэй; Стоддард, Барри Л.; Селигман, Ленни М. (2004). «Выделение и характеристика новых специфичностей самонаводящихся эндонуклеаз в индивидуальных целевых позициях». Журнал молекулярной биологии . 342 (1): 31–41. doi :10.1016/j.jmb.2004.07.031. PMID  15313605.
  7. ^ Rosen, LE; Morrison, HA; Masri, S.; Brown, MJ; Springstubb, B.; Sussman, D.; Stoddard, BL; Seligman, LM (2006). «Производные самонаводящейся эндонуклеазы I-CreI с новой целевой специфичностью ДНК». Nucleic Acids Research . 34 (17): 4791–800. doi :10.1093/nar/gkl645. PMC 1635285. PMID  16971456 . 
  8. ^ Арнульд, Сильвен; Шамс, Патрик; Перес, Кристоф; Лакруа, Эммануэль; Дюклер, Эмерик; Эпина, Жан-Шарль; Стрише, Франсуа; Пети, Анн-Софи; Патин, Амели (2006). «Инженерия большого количества высокоспецифичных самонаводящихся эндонуклеаз, которые вызывают рекомбинацию на новых ДНК-мишенях». Журнал молекулярной биологии . 355 (3): 443–58. doi :10.1016/j.jmb.2005.10.065. PMID  16310802.
  9. ^ Смит, Дж.; Гризо, С.; Арнольд, С.; Дюклер, А.; Эпинат, Ж.-К.; Чамс, П.; Прието, Дж.; Редондо, П.; Бланко, Ф.Дж. (2006). "Комбинаторный подход к созданию искусственных самонаводящихся эндонуклеаз, расщепляющих выбранные последовательности". Nucleic Acids Research . 34 (22): e149. doi :10.1093/nar/gkl720. PMC 1702487 . PMID  17130168. 
  10. ^ Шевалье, Бретт С.; Кортемме, Таня ; Чедси, Мегген С.; Бейкер, Дэвид; Моннат, Рэймонд Дж.; Стоддард, Барри Л. (2002). «Дизайн, активность и структура высокоспецифичной искусственной эндонуклеазы». Molecular Cell . 10 (4): 895–905. doi : 10.1016/S1097-2765(02)00690-1 . PMID  12419232.
  11. ^ Grizot, S.; Epinat, JC; Thomas, S.; Duclert, A.; Rolland, S.; Paques, F.; Duchateau, P. (2009). «Создание перепроектированных самонаводящихся эндонуклеаз, включающих ДНК-связывающие домены, полученные из двух разных каркасов». Nucleic Acids Research . 38 (6): 2006–18. doi :10.1093/nar/gkp1171. PMC 2847234. PMID 20026587  . 
  12. ^ Гао, Хуэйронг; Смит, Джефф; Ян, Мейчжу; Джонс, Спенсер; Джуканович, Весна; Николсон, Майкл Г.; Уэст, Анд; Бидни, Деннис; Фалько, С. Карл (2010). «Наследуемый направленный мутагенез в кукурузе с использованием разработанной эндонуклеазы». The Plant Journal . 61 (1): 176–87. doi : 10.1111/j.1365-313X.2009.04041.x . PMID  19811621.
  13. ^ http://www.research.bayer.com/en/straight-into-the-cotton-genome.aspx [ необходима полная ссылка ]
  14. ^ Буассель, Сандрин; Жарджор, Джордан; Астрахан, Александр; Адей, Эндрю; Губл, Агнес; Дюшато, Филипп; Шендюр, Джей; Стоддард, Барри Л.; Серто, Майкл Т. (2014-02-01). "megaTALs: архитектура редкорасщепляющей нуклеазы для терапевтической генной инженерии". Nucleic Acids Research . 42 (4): 2591–2601. doi :10.1093/nar/gkt1224. ISSN  1362-4962. PMC 3936731. PMID  24285304 . 
  15. ^ Certo, Michael T; Gwiazda, Kamila S; Kuhar, Ryan; Sather, Blythe; Curinga, Gabrielle; Mandt, Tyler; Brault, Michelle; Lambert, Abigail R; Baxter, Sarah K (2012-10-01). "Сопряжение эндонуклеаз с ферментами обработки концов ДНК для управления нарушением генов". Nature Methods . 9 (10): 973–975. doi :10.1038/nmeth.2177. ISSN  1548-7091. PMC 3602999 . PMID  22941364. 
  16. ^ Делакот, Фабьен; Перес, Кристоф; Гайо, Валери; Дюамель, Марианна; Рошон, Кристель; Оливье, Натали; Макмастер, Рэйчел; Сильва, Джордж Х.; Пакес, Фредерик (1 января 2013 г.). «Высокочастотный целевой мутагенез с использованием сконструированных эндонуклеаз и ферментов, обрабатывающих концы ДНК». ПЛОС ОДИН . 8 (1): e53217. Бибкод : 2013PLoSO...853217D. дои : 10.1371/journal.pone.0053217 . ISSN  1932-6203. ПМЦ 3554739 . ПМИД  23359797. 
  17. ^ Валтон, Жюльен; Дабусси, Файза; Ледюк, Софи; Молина, Рафаэль; Редондо, Пилар; Макмастер, Рэйчел; Монтойя, Гильермо; Дюшато, Филипп (31 августа 2012 г.). «Метилирование 5′-цитозина-фосфогуанина (CpG) влияет на активность природных и сконструированных мегануклеаз». Журнал биологической химии . 287 (36): 30139–30150. doi : 10.1074/jbc.M112.379966 . ISSN  0021-9258. PMC 3436367. PMID  22740697 . 
  18. ^ Дабусси, Файза; Заславский, Михаил; Пуаро, Лоран; Лоперфидо, Мариана; Губл, Аньес; Гийо, Валери; Ледюк, Софи; Галетто, Роман; Гризо, Сильвестр (29.03.2012). «Хромосомный контекст и эпигенетические механизмы контролируют эффективность редактирования генома редкоразрезающими дизайнерскими эндонуклеазами». Nucleic Acids Research . 40 (13): 6367–6379. doi :10.1093/nar/gks268. ISSN  0305-1048. PMC 3401453. PMID  22467209 . 
  19. ^ "Патент США на хромосомную модификацию, включающую индукцию расщепления двухцепочечной ДНК и гомологичную рекомбинацию в месте расщепления Патент (Патент № 8,921,332, выдан 30 декабря 2014 г.) - Поиск патентов Justia". patents.justia.com . Получено 19.02.2016 .
  20. ^ "Cellectis объявляет о выдаче USPTO патента, охватывающего метод "редактирования генов" на основе семенной нуклеазы | cellectis". www.cellectis.com . Архивировано из оригинала 2016-03-02 . Получено 2016-02-19 .

Внешние ссылки