Статическое рассеяние света

Статическое светорассеяние — это метод физической химии , который измеряет интенсивность рассеянного света для определения средней молекулярной массы M _w макромолекулы, такой как полимер или белок, в растворе. Измерение интенсивности рассеяния под многими углами позволяет рассчитать среднеквадратичный радиус, также называемый радиусом инерции R _g . Измеряя интенсивность рассеяния для многих образцов различной концентрации, можно рассчитать второй вириальный коэффициент A ₂ ^{. [1] [2] [3] [4] [5]}

Статическое рассеяние света также обычно используется для определения размера суспензий частиц в суб- и супра-мкм диапазонах с помощью формализмов Лоренца-Ми (см. Рассеяние Ми ) и дифракционного формализма Фраунгофера соответственно.

В экспериментах по статическому светорассеянию в раствор, содержащий макромолекулы, направляется монохроматический свет высокой интенсивности, обычно лазер. Один или несколько детекторов используются для измерения интенсивности рассеяния под одним или несколькими углами. Угловая зависимость необходима для получения точных измерений как молярной массы, так и размера для всех макромолекул с радиусом более 1–2% падающей длины волны. Следовательно, одновременные измерения под несколькими углами относительно направления падающего света, известные как многоугловое рассеяние света (MALS) или многоугловое рассеяние лазерного света (MALLS), обычно считаются стандартной реализацией статического рассеяния света. Дополнительные подробности истории и теории MALS можно найти в многоугловом рассеянии света .

Для непосредственного измерения средней молекулярной массы без калибровки по интенсивности светорассеяния необходимо знать интенсивность лазера, квантовую эффективность детектора, а также полный объем рассеяния и телесный угол детектора. Поскольку это непрактично, все коммерческие приборы калибруются с использованием сильного известного рассеивателя, такого как толуол, поскольку коэффициент Рэлея толуола и некоторых других растворителей измерялся с использованием прибора абсолютного светорассеяния.

Теория

Для прибора рассеяния света, состоящего из множества детекторов, расположенных под разными углами, все детекторы должны реагировать одинаково. Обычно детекторы имеют немного разную квантовую эффективность , разные коэффициенты усиления и рассматривают разные геометрические объемы рассеяния. В этом случае нормализация детекторов совершенно необходима. Для нормализации детекторов сначала проводят измерение чистого растворителя. Затем к растворителю добавляют изотропный рассеиватель. Поскольку изотропные рассеиватели рассеивают одинаковую интенсивность под любым углом, с помощью этой процедуры можно нормализовать эффективность и усиление детектора. Удобно нормализовать все детекторы на угол детектора 90°.

${\displaystyle \ N(\theta )={\frac {I_{R}(\theta )-I_{S}(\theta )}{I_{R}(90)-I_{S}(90)}}}$

где I _R (90) — интенсивность рассеяния, измеренная для рэлеевского рассеивателя угловым детектором 90°.

Наиболее распространенным уравнением для измерения средневесовой молекулярной массы M _w является уравнение Зимма ^[5] (правая часть уравнения Зимма в некоторых текстах представлена ​​неправильно, как отмечают Хименц и Лодж): ^{[6] ]}

${\displaystyle {\frac {Kc}{\Delta R(\theta ,c)}}={\frac {1}{M_{w}}}\left(1+{\frac {q^{2}R_{g}^{2}}{3}}+O(q^{4})\right)+2A_{2}c+O(c^{2})}$

где

${\displaystyle \ K=4\pi ^{2}n_{0}^{2}(dn/dc)^{2}/N_{\text{A}}\lambda ^{4}}$

и

${\displaystyle \ \Delta R(\theta ,c)=R_{A}(\theta )-R_{0}(\theta )}$

с

${\displaystyle \ R(\theta )={\frac {I_{A}(\theta )n_{0}^{2}}{I_{T}(\theta )n_{T}^{2}}}{\frac {R_{T}}{N(\theta )}}}$

а вектор рассеяния для вертикально поляризованного света равен

${\displaystyle \ q=4\pi n_{0}\sin(\theta /2)/\lambda }$

где n _{0 -} показатель преломления растворителя, λ - длина волны источника света, N _{A -} постоянная Авогадро , c - концентрация раствора, а d n /d c - изменение показателя преломления раствора с изменением концентрации. Интенсивность аналита, измеренная под углом, равна I _A (θ) . В этих уравнениях нижний индекс A относится к аналиту (раствору), а T соответствует толуолу с коэффициентом Рэлея толуола, R _T составляет 1,35×10 ^-5  см ^-1 для HeNe-лазера . Как описано выше, радиус инерции R _g и второй вириальный коэффициент A ₂ также рассчитываются из этого уравнения. Приращение показателя преломления dn/dc характеризует изменение показателя преломления n с концентрацией c и может быть измерено дифференциальным рефрактометром.

График Зимма строится на основе двойной экстраполяции к нулевому углу и нулевой концентрации под многими углами и множеством измерений концентрации. В простейшей форме уравнение Зимма сводится к:

${\displaystyle \ Kc/\Delta R(\theta \rightarrow 0,c\rightarrow 0)=1/M_{w}}$

для измерений, выполненных под малым углом и бесконечным разбавлением, поскольку P (0) = 1.

Обычно разрабатывается несколько анализов для анализа рассеяния частиц в растворе с целью получения вышеупомянутых физических характеристик частиц. Простой эксперимент по статическому рассеянию света предполагает, что средняя интенсивность образца с поправкой на рассеяние растворителя даст коэффициент Рэлея R как функцию угла или волнового вектора q следующим образом:

Анализ данных

сюжет Гинье

Рассеянную интенсивность можно построить как функцию угла, чтобы получить информацию о R _g , которую можно просто рассчитать с использованием приближения Гинье следующим образом:

${\displaystyle \ln(\Delta R(\theta ))=1-(R_{g}^{2}/3)q^{2}}$

где ln(ΔR(θ)) = lnP(θ), также известный как форм-фактор с q = 4πn ₀ sin(θ/2)/λ . Следовательно, график скорректированного коэффициента Рэлея, ΔR(θ) в зависимости от sin ² (θ/2) или q ² , даст наклон R _g ² /3 . Однако это приближение справедливо только для qR _g < 1 . Обратите внимание, что для графика Гинье значение dn/dc и концентрации не требуется.

Краткий сюжет

График Кратки обычно используется для анализа конформации белков, но его можно использовать и для анализа модели случайного блуждания полимеров . График Кратки можно построить, построив график зависимости sin ² (θ/2)ΔR(θ) от sin(θ/2) или q ² ΔR(θ) от q .

Оценка измерения статического светорассеяния с использованием графика Зимма

Сюжет Зимма

Для полимеров и полимерных комплексов, которые являются монодисперсными ( ), что определяется статическим светорассеянием, график Зимма является обычным средством получения таких параметров, как R _g , молекулярная масса M _w и второй вириальный коэффициент A ₂ . ${\displaystyle \scriptstyle \mu _{2}/{\bar {\Gamma }}^{2}<0.3}$

Следует отметить, что если константа материала K не реализована, график Зимма даст только R _g . Следовательно, реализация K приведет к следующему уравнению:

${\displaystyle {\frac {Kc}{\Delta R(\theta ,c)}}={\frac {1}{M_{w}}}\left(1+{\frac {q^{2}R_{g}^{2}}{3}}+O(q^{4})\right)+2A_{2}c+O(c^{2})}$

Анализ, выполненный с использованием графика Зимма, использует двойную экстраполяцию до нулевой концентрации и нулевого угла рассеяния, что приводит к характерному ромбовидному графику. Поскольку угловая информация доступна, также можно получить радиус вращения ( R _g ). Эксперименты проводятся под несколькими углами, удовлетворяющими условию, и не менее 4 концентраций. Выполнение анализа Зимма для одной концентрации известно как частичный анализ Зимма и справедливо только для разбавленных растворов сильных точечных рассеивателей. Однако частичный Зимм не дает второго вириального коэффициента из-за отсутствия переменной концентрации образца. Более конкретно, значение второго вириального коэффициента либо предполагается равным нулю, либо вводится как известное значение для выполнения частичного анализа Зимма. ${\displaystyle qR_{g}<1}$

График Дебая

Расчет молекулярной массы путем измерения статического светорассеяния с использованием графика Дебая ^[7]

Если измеренные частицы меньше λ/20, то формфактором P(θ) можно пренебречь ( P(θ) →1). Таким образом, уравнение Зимма упрощается до уравнения Дебая следующим образом:

${\displaystyle {\frac {Kc}{\Delta R(\theta ,c)}}={\frac {1}{M_{w}}}+2A_{2}c}$

Обратите внимание, что это также результат экстраполяции до нулевого угла рассеяния. Путем получения данных о концентрации и интенсивности рассеяния строится график Дебая путем построения графика зависимости Kc / ΔR(θ) от концентрации. Пересечение подобранной линии дает молекулярную массу, а наклон соответствует 2- ^му вириальному коэффициенту.

Поскольку график Дебая представляет собой упрощение уравнения Зимма, применяются те же ограничения последнего, т.е. образцы должны иметь монодисперсную природу. Для полидисперсных образцов молекулярная масса, полученная в результате измерения статического светорассеяния, будет представлять собой среднее значение. Преимуществом графика Дебая является возможность определения второго вириального коэффициента. Этот параметр описывает взаимодействие между частицами и растворителем. Например, в растворах макромолекул он может принимать отрицательные (предпочтительны взаимодействия частица-растворитель), нулевые или положительные значения (предпочтительны взаимодействия частица-растворитель). ^[8]

Многократное рассеяние

Статическое рассеяние света предполагает, что каждый обнаруженный фотон рассеивался ровно один раз. Следовательно, анализ в соответствии с приведенными выше расчетами будет правильным только в том случае, если образец был достаточно разбавлен, чтобы гарантировать, что фотоны не рассеиваются образцом многократно перед тем, как они будут обнаружены. Точная интерпретация становится чрезвычайно сложной для систем с существенным вкладом многократного рассеяния. Во многих коммерческих приборах, где анализ сигнала рассеяния выполняется автоматически, пользователь может никогда не заметить ошибку. Это ограничивает применение стандартного статического светорассеяния до очень низких концентраций частиц, особенно для более крупных частиц и частиц с высоким контрастом показателей преломления. С другой стороны, для растворимых макромолекул, которые демонстрируют относительно низкий контраст показателя преломления по сравнению с растворителем, включая большинство полимеров и биомолекул в соответствующих растворителях, многократное рассеяние редко является ограничивающим фактором даже при концентрациях, приближающихся к пределам растворимости.

Однако, как показал Шетцель ^[9] , можно подавить многократное рассеяние в экспериментах по статическому светорассеянию с помощью подхода кросс-корреляции. Общая идея состоит в том, чтобы изолировать однократно рассеянный свет и подавить нежелательный вклад многократного рассеяния в эксперименте по статическому рассеянию света. Были разработаны и применены различные реализации кросс-корреляционного рассеяния света. В настоящее время наиболее широко используемой схемой является так называемый метод 3D-динамического рассеяния света. ^{[10] [11]} Тот же метод можно также использовать для коррекции данных динамического рассеяния света за счет многократного рассеяния. ^[12]

Статическое светорассеяние с градиентом состава

Образцы, которые меняют свои свойства после разбавления, нельзя анализировать с помощью статического рассеяния света в рамках простой модели, представленной здесь как уравнение Зимма. Более сложный анализ, известный как «статическое (или многоугловое) светорассеяние в градиенте состава» (CG-SLS или CG-MALS), представляет собой важный класс методов исследования белок-белковых взаимодействий , коллигативных свойств и других макромолекулярных взаимодействий, таких как помимо размера и молекулярной массы он дает информацию о сродстве и стехиометрии молекулярных комплексов, образованных одним или несколькими ассоциированными макромолекулярными/биомолекулярными видами. В частности, статическое светорассеяние от серии разбавлений можно анализировать для количественной оценки самоассоциации, обратимой олигомеризации и неспецифического притяжения или отталкивания, тогда как статическое светорассеяние от смесей видов можно анализировать для количественной оценки гетероассоциации. ^[13]

Приложения

Одно из основных применений статического рассеяния света для определения молекулярной массы находится в области макромолекул, таких как белки и полимеры, ^{[14] [15] [16],} поскольку можно измерить молекулярную массу белков без каких-либо предположений о их форма. Статическое светорассеяние обычно комбинируется с другими методами определения характеристик частиц, такими как эксклюзионная хроматография (SEC), динамическое светорассеяние (DLS) и электрофоретическое светорассеяние (ELS).

Смотрите также

• Дифференциальное статическое рассеяние света (DSLS)
• Динамическое рассеяние света
• Рассеяние света
• Белково-белковые взаимодействия

Рекомендации

1. А. Эйнштейн (1910). «Теория опалесценции фон гомогенных Flüssigkeiten und Flüssigkeitsgemischen in der Nähe des kritischen Zustandes». Анналы физики . 33 (16): 1275. Бибкод : 1910АнП...338.1275Е. дои : 10.1002/andp.19103381612.
2. К.В. Раман (1927). «Связь эффекта Тиндаля с осмотическим давлением в коллоидных растворах». Индиан Дж. Физ . 2 : 1.
3. П.Дебай (1944). «Светорассеяние в растворах». Дж. Прил. Физ . 15 (4): 338. Бибкод : 1944JAP....15..338D. дои : 10.1063/1.1707436.
4. Б. Х. Зимм (1945). «Молекулярная теория рассеяния света в жидкостях». Дж. Хим. Физ . 13 (4): 141. Бибкод : 1945ЖЧФ..13..141З. дои : 10.1063/1.1724013.
5. Б.Х. Зимм (1948). «Рассеяние света и функция радиального распределения растворов высоких полимеров». Дж. Хим. Физ . 16 (12): 1093. Бибкод : 1948ЖЧФ..16.1093З. дои : 10.1063/1.1746738.
6. Хименц, Пол С.; Лодж, Тимоти П. (2007). Химия полимеров (2-е изд.). Бока-Ратон, Флорида [ua]: CRC Press. стр. 307–308. ISBN 978-1-57444-779-8.
7. «Измерение молекулярной массы с использованием статического рассеяния света :: Anton Paar Wiki». Антон Паар . Проверено 23 сентября 2022 г.
8. Чанг, Цин (2016), «Осмотическое давление», Коллоидная и межфазная химия для контроля качества воды , Elsevier, стр. 37–47, doi : 10.1016/b978-0-12-809315-3.00004-9, ISBN 978-0-12-809315-3, получено 14 июня 2022 г.
9. Шетцель, К. (1991). «Подавление многократного рассеяния с помощью методов взаимной корреляции фотонов». Дж. Мод. Опц . 38 : SA393–SA398. Бибкод : 1990JPCM....2..393S. дои : 10.1088/0953-8984/2/S/062. S2CID  250745836.
10. Урбан, К.; Шуртенбергер, П. (1998). «Характеристика мутных коллоидных суспензий с использованием методов светорассеяния в сочетании с методами взаимной корреляции». J. Наука о коллоидном интерфейсе . 207 (1): 150–158. Бибкод : 1998JCIS..207..150U. doi : 10.1006/jcis.1998.5769. ПМИД  9778402.
11. Блок, И.; Шеффолд, Ф. (2010). «Модулированное трехмерное кросс-корреляционное рассеяние света: улучшение характеристик мутных образцов». Обзор научных инструментов . 81 (12): 123107–123107–7. arXiv : 1008.0615 . Бибкод : 2010RScI...81l3107B. дои : 10.1063/1.3518961. PMID  21198014. S2CID  9240166.
12. Пьюзи, ПН (1999). «Подавление многократного рассеяния методами взаимной корреляции фотонов». Текущее мнение в области коллоидной и интерфейсной науки . 4 (3): 177–185. дои : 10.1016/S1359-0294(99)00036-9.
13. Некоторые, Д. (2013). «Анализ биомолекулярных взаимодействий на основе светорассеяния». Биофиз. Преподобный . 5 (2): 147–158. дои : 10.1007/s12551-013-0107-1. ПМК 3641300 . ПМИД  23646069. 
14. Седлак, Мариан (1 марта 2006 г.). «Крупномасштабная супрамолекулярная структура в растворах низкомолярных соединений и смесях жидкостей: I. Характеристика светорассеяния». Журнал физической химии Б. 110 (9): 4329–4338. дои : 10.1021/jp0569335. ISSN  1520-6106. ПМИД  16509731.
15. Диас-Ласприлья, Ана М.; Меркадо, Рональд А.; Рамирес-Кабальеро, Густаво Э. (20 июня 2021 г.). «Влияние степени полимеризации глицерина на эмульгирующие свойства эфиров полиглицерина». Журнал прикладной науки о полимерах . 138 (24): 50566. doi :10.1002/app.50566. ISSN  0021-8995. S2CID  233888953.
16. «Димеризация бычьего сывороточного альбумина, подтвержденная измерением размера частиц и молекулярной массы :: Anton-Paar.com». Антон Паар . Проверено 14 июня 2022 г.

Внешние ссылки

• Применение статического светорассеяния
• Litesizer