МикроДНК является наиболее распространенным подтипом внехромосомной кольцевой ДНК (вкДНК) у людей, обычно имеет длину от 200 до 400 пар оснований и обогащена неповторяющимися геномными последовательностями с высокой плотностью экзонов. [2] [3] [4] Кроме того, было обнаружено, что микроДНК происходит из областей с CpG-островками , которые обычно встречаются в пределах 5' и 3' UTR. [3] [4] [5] Предполагается, что микроДНК образуется из областей активной транскрипции и может образовываться как побочный продукт восстановления транскрипционных повреждений ДНК. [5] Считается, что микроДНК также возникает из других путей репарации ДНК, в основном из-за родительских последовательностей микроДНК, имеющих от 2 до 15 пар оснований прямых повторов на концах, что приводит к репарации проскальзывания репликации. [3] Хотя это было обнаружено совсем недавно, роль микроДНК, которую играет внутри клетки и вне ее, до сих пор не до конца понятна. [5] Однако в настоящее время считается, что микроДНК влияет на клеточный гомеостаз посредством связывания факторов транскрипции и используется в качестве биомаркера рака. [5] [6] [7]
МикроДНК была обнаружена с помощью протоколов, аналогичных протоколам экстракции вкДНК. [5] В частности, клоны эккДНК были созданы посредством множественной амплификации смещения и секвенированы с помощью секвенирования Сэнгера , что привело к открытию микроДНК. [5] Теперь, когда высокопроизводительное секвенирование стало более распространенной практикой, полная геномная последовательность вкДНК млекопитающих была получена посредством секвенирования продуктов скользящей амплификации вкДНК. [5] Затем были использованы вычислительные методы для идентификации соединительных последовательностей в ДНК. [4] Пики, обнаруженные на длинах 180 и 380 п.о., были обнаружены как микроДНК и охарактеризованы их CpG-островками и фланкирующими прямыми повторами длиной от 2 до 15 п.н. [4]
С момента своего открытия микроДНК была идентифицирована во всех типах тканей и различных образцах, включая ткани мышей и линии раковых клеток человека. [5] [6] Однако разные виды имеют уникальные геномные участки, которые специфически производят микроДНК. [5] Поскольку существуют общие геномные пятна, которые производят микроДНК во многих типах клеток и тканей одного вида, есть свидетельства того, что они не могут производиться исключительно как побочный продукт синтеза ДНК. [5] Однако исследования выявили отдельные кластеры микроДНК, извлеченные из клеточных линий разных тканей, что позволяет предположить, что образование может быть связано с клеточным происхождением и уникальной транскрипционной средой, обнаруженной в разных типах клеток. [4] [5]
Хотя образование микроДНК до сих пор не установлено, оно связано с транскрипционной активностью и множеством путей репарации ДНК. [3] [5] Поскольку микроДНК образуется из областей с высокой транскрипционной активностью/плотностью экзонов, она может образовываться в результате репарации ДНК во время транскрипции. [5] Интересно, что трехцепочечные гибриды ДНК:РНК, образующиеся во время транскрипции, называемые R-петлями , имеют тенденцию образовываться на CpG-островках внутри 5'- и 3'-UTR, подобно микроДНК. [3] [5] R-петли коррелируют с повреждением ДНК и генетической нестабильностью, что позволяет предположить, что микроДНК может образовываться из петли одноцепочечной ДНК (оцДНК) во время реакции повреждения ДНК для R-петлей. [3] [5] [6]
При репликации ДНК коротких прямых повторов (как обнаружено во фланкирующих областях источников генов микроДНК) возможно образование петель ДНК на родительской цепи или цепи продукта в результате проскальзывания репликации. [3] [5] Чтобы исправить это, путь восстановления несоответствия (MMR) может удалить петлю, и после лигирования повторяющихся концов может быть получена одноцепочечная микроДНК. [3] Оц-микроДНК затем преобразуется в двухцепочечную ДНК; этот процесс до сих пор неизвестен. [5] Важно отметить, что если петля образуется на вновь реплицированной цепи, в геноме не происходит последовательной делеции, тогда как микроделеции могут образовываться в результате вырезания в матричной цепи. [3] [5] Чтобы понять роль, которую MMR может играть в биогенезе микроДНК, анализ содержания микроДНК был проведен в клетках DT40 после удаления MSH3 , важного белка в MMR. [3] [5] Полученная микроДНК из клеточной линии DT40 MSH3-/- имела более высокое обогащение CpG-островками по сравнению с диким типом, а также более чем на 80% снижение количества двухцепочечной микроДНК. [3] [5] Таким образом, предполагается, что путь MMR необходим для производства микроДНК из не-CpG-островков в геноме, тогда как микроДНК, обогащенная CpG, образуется с помощью другого пути репарации. [3]
Опять же, из-за микрогомологии матричного генома, если происходит разрыв ДНК или пауза в репликации (остановка репликационной вилки), вновь синтезированная ДНК может циркулировать в оц-микроДНК. [3] [5] Это означает, что когда ДНК-матрица восстанавливается после создания микроДНК, делеции не происходит. [3]
МикроДНК, создаваемая по пути MMR и остановка репликационной вилки, является результатом ошибок репликации ДНК, однако есть свидетельства присутствия микроДНК и в неделящихся клетках. [5] Это означает, что некоторая микроДНК вырабатывается посредством путей восстановления, которые также происходят в покоящихся клетках, например, на 5'-концах элементов LINE1 , которые, как известно, транспонируются. [3] [5] Для перемещения по геному ДНК-транспозоны требуют транспозазы , чтобы удалить транспозон из исходного сайта и катализировать его вставку в другом месте генома. [3] Таким образом, транспозон создается в результате двух двухцепочечных разрывов ДНК, что также приводит к микроделеции в ДНК. [3] Этот фрагмент дцДНК можно циркулировать посредством микрогомологической циркуляризации, создавая дц-микроДНК. [3]
МикроДНК длиной 200–400 п.н. слишком мала для кодирования белков, однако она может быть важна для молекулярного спонжирования. [4] [5] Факторы транскрипции часто связываются с промотором или регуляторными последовательностями на 5'-конце ДНК, чтобы инициировать транскрипцию. [5] Эти факторы транскрипции также могут связываться с соответствующими сайтами узнавания на микроДНК, поскольку микроДНК часто происходит из 5'-UTR своего родительского гена и, таким образом, действует как губка для факторов транскрипции. [4] [5] Это означает, что микроДНК может косвенно контролировать экспрессию генов и гомеостаз транскрипции. [4] [5]
В целом, молекулы нуклеиновых кислот, которые обнаруживаются в кровотоке и называются циркулирующими или бесклеточными, представляют собой относительно новые биомаркеры заболеваний, которые изучаются, в том числе для диагностики и прогрессирования рака. [7] Эти молекулы, такие как внеклеточная ДНК (вкДНК), высвобождаются в кровь при гибели клеток и в случаях рака, их можно идентифицировать на основе известных мутаций в онкогенах. [7]
Недавние исследования расширили использование бесклеточных нуклеиновых кислот в качестве биомаркеров рака до микроДНК. [7] ВкмикроДНК была получена из сыворотки человека и мыши, и из-за их сходства с микроДНК клеточного происхождения, как описано выше, был сделан вывод, что вкмикроДНК вырабатывается в клетке. [7] Аналогичным образом, при сравнении легочной ткани до и после удаления опухоли не было обнаружено различий в ключевых характеристиках циркулирующей микроДНК, кроме неожиданной тенденции к более длинным циркулирующим последовательностям микроДНК у онкологических больных до удаления опухоли. [7] После операции длина cfmicroDNA оказалась короче. [7]
Бесклеточная ДНК быстро выводится из крови, что делает ее трудным биомаркером рака. [7] Однако, поскольку кольцевая ДНК не подвержена разрыву ДНК под действием РНКазы и экзонуклеазы , она более стабильна, чем линейная ДНК. [5] [7] В сочетании с наблюдаемым удлинением cfmicroDNA в сыворотке больных раком это делает циркулирующую микроДНК хорошим биомаркером рака как для диагностики, так и для прогрессирования после лечения. [7]