Микроинъекция — это использование стеклянной микропипетки для инъекции жидкого вещества на микроскопическом или пограничном макроскопическом уровне. Целью часто является живая клетка, но может также включать межклеточное пространство. Микроинъекция — это простой механический процесс, обычно включающий инвертированный микроскоп с увеличением около 200x (хотя иногда он выполняется с использованием препарирующего стереомикроскопа с увеличением 40–50x или традиционного составного прямого микроскопа с мощностью, аналогичной инвертированной модели).
Для таких процессов, как клеточная или пронуклеарная инъекция, целевая клетка располагается под микроскопом, и два микроманипулятора — один с пипеткой, а другой с микрокапиллярной иглой, обычно диаметром от 0,5 до 5 мкм (больше, если вводить стволовые клетки в эмбрион) — используются для проникновения через клеточную мембрану и/или ядерную оболочку . [1] Таким образом, этот процесс можно использовать для введения вектора в отдельную клетку. Микроинъекция также может использоваться при клонировании организмов, при изучении биологии клетки и вирусов, а также для лечения мужской субфертильности с помощью интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ, / ˈ ɪ k s i / IK -см. ).
Использование микроинъекции как биологической процедуры началось в начале двадцатого века, хотя даже в 1970-х годах она не использовалась повсеместно. К 1990-м годам ее использование значительно возросло, и теперь она считается распространенной лабораторной техникой, наряду с слиянием везикул , электропорацией , химической трансфекцией и вирусной трансдукцией , для введения небольшого количества вещества в небольшую мишень. [2]
Существует два основных типа систем микроинъекции. Первая называется системой постоянного потока , а вторая называется системой импульсного потока . В системе постоянного потока, которая является относительно простой и недорогой, хотя и неуклюжей и устаревшей, постоянный поток образца доставляется из микропипетки , а количество вводимого образца определяется тем, как долго игла остается в клетке. Для этой системы обычно требуется регулируемый источник давления, держатель капилляра и либо грубый, либо тонкий микроманипулятор. Однако система импульсного потока обеспечивает больший контроль и последовательность в отношении количества вводимого образца: наиболее распространенная схема для интрацитоплазматической инъекции спермы включает инжектор Eppendorf "Femtojet", соединенный с Eppendorf "InjectMan", хотя процедуры, включающие другие цели, обычно используют гораздо менее дорогое оборудование с аналогичными возможностями. Благодаря повышенному контролю над размещением и движением иглы и в дополнение к повышенной точности в отношении объема доставляемого вещества, метод импульсного потока обычно приводит к меньшему повреждению принимающей клетки, чем метод постоянного потока. Однако линейка Eppendorf, по крайней мере, имеет сложный пользовательский интерфейс , а ее отдельные системные компоненты обычно намного дороже тех, которые необходимы для создания системы постоянного потока или других систем впрыска с импульсным потоком. [3]
Пронуклеарная инъекция — это метод создания трансгенных организмов путем введения генетического материала в ядро оплодотворенной яйцеклетки . Этот метод обычно используется для изучения роли генов с использованием мышиных животных-моделей.
Пронуклеарная инъекция спермы мыши является одним из двух наиболее распространенных методов получения трансгенных животных (наряду с генной инженерией эмбриональных стволовых клеток ). [4] Для того чтобы пронуклеарная инъекция была успешной, генетический материал (обычно линейная ДНК ) должен быть введен, когда генетический материал из ооцита и спермы разделены (т. е. пронуклеарная фаза ). [5] Для того чтобы получить эти ооциты, мышей обычно подвергают суперовуляции с использованием гонадотропинов . [6] После того, как произошло закупоривание , ооциты извлекают из мыши и вводят в них генетический материал. Затем ооцит имплантируют в яйцевод псевдобеременного животного . [5] Хотя эффективность варьируется, 10-40% мышей, рожденных из этих имплантированных ооцитов, могут содержать введенную конструкцию . [6] Затем трансгенных мышей можно разводить для создания трансгенных линий.