Микроскопия флуоресцентной визуализации в течение жизни

Метод визуализации, основанный на флуоресценции

Микроскопия визуализации флуоресценции с временем жизни или FLIM — это метод визуализации, основанный на различиях в экспоненциальной скорости затухания фотонного излучения флуорофора из образца. Его можно использовать в качестве метода визуализации в конфокальной микроскопии , микроскопии с двухфотонным возбуждением и многофотонной томографии.

Для создания изображения в FLIM используется время жизни флуоресценции (FLT) флуорофора, а не его интенсивность. Время жизни флуоресценции зависит от локального микроокружения флуорофора, что исключает любые ошибочные измерения интенсивности флуоресценции из-за изменения яркости источника света, интенсивности фонового освещения или ограниченного фотообесцвечивания. Этот метод также имеет преимущество в минимизации эффекта рассеяния фотонов в толстых слоях образца. Будучи зависимыми от микроокружения, измерения времени жизни использовались в качестве индикатора для pH , ^[1] вязкости ^{[2] и} концентрации химических веществ . ^{[3] [4]}

Продолжительность жизни флуоресценции

Флуорофор , возбужденный фотоном , с определенной вероятностью перейдет в основное состояние , исходя из скоростей распада через ряд различных (радиационных и/или нерадиационных) путей распада. Для наблюдения флуоресценции один из этих путей должен быть спонтанным испусканием фотона. В ансамблевом описании испускаемая флуоресценция будет со временем затухать в соответствии с

${\displaystyle I(t)=I_{0}e^{-t/\tau }}$

где

${\displaystyle {\frac {1}{\tau }}=\sum k_{i}}$.

В приведенном выше примере — время, — время жизни флуоресценции, — начальная флуоресценция при , и — скорости для каждого пути распада, по крайней мере один из которых должен быть скоростью распада флуоресценции . Что еще более важно, время жизни не зависит от начальной интенсивности и испускаемого света. Это можно использовать для проведения измерений, не основанных на интенсивности, в химическом зондировании. ^[5] ${\displaystyle t}$ ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle I_{0}}$ ${\displaystyle t=0}$ ${\displaystyle k_{i}}$ ${\displaystyle k_{f}}$ ${\displaystyle \tau }$

Измерение

Визуализация на основе времени жизни флуоресценции позволяет получать изображения с интенсивностью каждого пикселя, определяемой , что позволяет наблюдать контраст между материалами с различной скоростью затухания флуоресценции (даже если эти материалы флуоресцируют на одной и той же длине волны), а также получать изображения, которые показывают изменения в других путях затухания, например, при визуализации FRET . ${\displaystyle \tau }$

Импульсное освещение

Время жизни флуоресценции можно определить во временной области с помощью импульсного источника. Когда популяция флуорофоров возбуждается ультракоротким или дельта -импульсом света, разрешенная по времени флуоресценция будет затухать экспоненциально, как описано выше. Однако, если импульс возбуждения или отклик обнаружения широкий, измеренная флуоресценция, d(t), не будет чисто экспоненциальной. Инструментальная функция отклика, IRF(t), будет свернута или смешана с функцией затухания, F(t).

${\displaystyle {d}(t)={IRF}(t)\otimes {F}(t)}$

Инструментальный отклик источника, детектора и электроники может быть измерен, как правило, из рассеянного возбуждающего света. Восстановление функции распада (и соответствующих времен жизни) создает дополнительные проблемы, поскольку деление в частотной области имеет тенденцию производить высокий шум, когда знаменатель близок к нулю.

TCSPC

Обычно используется коррелированный по времени подсчет отдельных фотонов ( TCSPC ), поскольку он компенсирует изменения интенсивности источника и амплитуды отдельных фотонных импульсов. Используя коммерческое оборудование TCSPC, можно записать кривую затухания флуоресценции с временным разрешением до 405 фс. ^{[ требуется ссылка ] [6]} Записанная гистограмма затухания флуоресценции подчиняется статистике Пуассона , которая учитывается при определении качества подгонки во время подгонки. Более конкретно, TCSPC записывает время, в которое отдельные фотоны обнаруживаются быстрым однофотонным детектором (обычно фотоумножительной трубкой (ФЭУ ) или однофотонным лавинным фотодиодом (SPAD)) по отношению к возбуждающему лазерному импульсу. Записи повторяются для нескольких лазерных импульсов, и после достаточного количества записанных событий можно построить гистограмму количества событий по всем этим записанным временным точкам. Затем эту гистограмму можно подогнать под экспоненциальную функцию, которая содержит интересующую экспоненциальную функцию затухания времени жизни, и соответственно можно извлечь параметр времени жизни. Многоканальные системы ФЭУ с 16 ^[7] до 64 элементов уже имеются в продаже, тогда как недавно продемонстрированные системы FLIM на основе однофотонных лавинных диодов КМОП (SPAD)-TCSPC могут предложить даже большее количество каналов обнаружения и дополнительные недорогие опции. ^[8]

Метод литникового контроля

В этом методе по-прежнему используется импульсное возбуждение. Прежде чем импульс достигает образца, часть света отражается дихроичным зеркалом и обнаруживается фотодиодом, который активирует генератор задержки, управляющий стробированным оптическим усилителем (GOI), который находится перед детектором CCD. GOI позволяет обнаруживать только часть времени, когда он открыт после задержки. Таким образом, с регулируемым генератором задержки можно собирать флуоресцентное излучение после нескольких времен задержки, охватывающих временной диапазон затухания флуоресценции образца. ^{[9] [10]} В последние годы на рынок вышли интегрированные усиленные камеры CCD. Эти камеры состоят из усилителя изображения, датчика CCD и интегрированного генератора задержки. Камеры ICCD с самым коротким временем стробирования до 200 пс и шагом задержки 10 пс позволяют использовать субнаносекундное разрешение FLIM. В сочетании с эндоскопом этот метод используется для интраоперационной диагностики опухолей головного мозга. ^[11]

Фазовая модуляция

Время жизни флуоресценции можно определить в частотной области методом фазовой модуляции. Метод использует источник света, который пульсирует или модулируется на высокой частоте (до 500 МГц), такой как светодиод, диодный лазер или источник непрерывной волны , объединенный с электрооптическим модулятором или акустооптическим модулятором . Флуоресценция (a.) демодулируется и (b.) смещается по фазе; обе величины связаны с характерными временами затухания флуорофора. Кроме того, y-компоненты синусоидальных волн возбуждения и флуоресценции будут модулироваться, и время жизни можно определить из соотношения модуляции этих y-компонент. Следовательно, 2 значения для времени жизни можно определить из метода фазовой модуляции. Время жизни определяется с помощью процедур подгонки этих экспериментальных параметров. Преимуществом частотной области FLIM на основе ФЭУ или камеры является его быстрое получение изображения за время жизни, что делает его пригодным для таких приложений, как исследование живых клеток. ^[12]

Анализ

Целью алгоритма анализа является извлечение чистой кривой распада из измеренного распада и оценка времени(й) жизни. Последнее обычно достигается путем подгонки одиночных или многоэкспоненциальных функций. Для решения этой проблемы были разработаны различные методы. Наиболее широко используемым методом является итеративная повторная свертка наименьших квадратов, которая основана на минимизации взвешенной суммы остатков. В этом методе теоретические экспоненциальные кривые распада свертываются с функцией отклика прибора, которая измеряется отдельно, и наилучшее соответствие находится путем итерационного расчета остатков для различных входов, пока не будет найден минимум. Для набора наблюдений флуоресцентного сигнала в интервале времени i оценка времени жизни выполняется путем минимизации: ${\displaystyle d({{t}_{i}})}$

${\displaystyle {{\chi }^{2}}=\sum \limits _{i}{{\left[{{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau )\right]}^{2}}}$

Помимо экспериментальных трудностей, включая функцию отклика прибора, зависящую от длины волны, математическая обработка итеративной проблемы деконволюции не является простой и представляет собой медленный процесс, который на ранних этапах FLIM делал его непрактичным для попиксельного анализа. Неподходящие методы привлекательны, поскольку они предлагают очень быстрое решение для оценки времени жизни. Одним из основных и простых методов в этой категории является метод быстрого определения времени жизни (RLD). RLD вычисляет время жизни и его амплитуды напрямую, разделяя кривую затухания на две части одинаковой ширины t. Анализ выполняется путем интегрирования кривой затухания в равные интервалы времени t: ${\displaystyle \delta }$ ${\displaystyle \delta }$

${\displaystyle {\begin{matrix}{{D}_{0}}=\sum \limits _{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t}&{{D}_{1}}=\sum \limits _{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t}\\\end{matrix}}}$

Ii — это записанный сигнал в i-м канале, а K — это количество каналов. Время жизни можно оценить с помощью:

${\displaystyle \tau =\delta t/\ln({{D}_{0}}/{{D}_{1}})}$

Для многоэкспоненциальных распадов это уравнение дает среднее время жизни. Этот метод можно расширить для анализа биэкспоненциальных распадов. Одним из основных недостатков этого метода является то, что он не может учитывать эффект отклика прибора, и по этой причине раннюю часть измеренных кривых распада следует игнорировать при анализе. Это означает, что часть сигнала отбрасывается, и точность оценки коротких времен жизни снижается.

Одной из интересных особенностей теоремы о свертке является то, что интеграл свертки является произведением факторов, составляющих интеграл. Существует несколько методов, которые работают в преобразованном пространстве и используют это свойство для восстановления чистой кривой затухания из измеренной кривой. Преобразование Лапласа и Фурье вместе с разложением Лагерра-Гаусса использовались для оценки времени жизни в преобразованном пространстве. Эти подходы быстрее, чем методы, основанные на деконволюции, но они страдают от проблем усечения и выборки. Более того, применение таких методов, как разложение Лагерра-Гаусса, математически сложно. В методах Фурье время жизни одной экспоненциальной кривой затухания определяется как:

${\displaystyle \tau ={\frac {1}{n\omega }}{\frac {{A}_{n}}{{B}_{n}}}}$

Где:

${\displaystyle {\begin{matrix}{{A}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\sin(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF(t)\sin(n\omega t)}}}={\frac {\omega \tau }{1+{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&{{B}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\cos(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF\cos(n\omega t)}}}={\frac {1}{1+n{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&\omega ={\frac {2\pi }{T}}\\\end{matrix}}}$

n — номер гармоники, T — общий временной диапазон обнаружения.

Приложения

FLIM в основном использовался в биологии как метод обнаружения фотосенсибилизаторов в клетках и опухолях, а также FRET в случаях, когда ратиометрическая визуализация затруднена. Метод был разработан в конце 1980-х и начале 1990-х годов (метод стробирования: Bugiel et al. 1989. König 1989, ^[13] Фазовая модуляция: Lakowicz at al. 1992, ^{[14] [15]} ), прежде чем стал более широко применяться в конце 1990-х годов. В клеточной культуре он использовался для изучения сигнализации рецептора EGF ^[16] и трафика. ^[17] Временной домен FLIM (tdFLIM) также использовался для демонстрации взаимодействия обоих типов ядерных промежуточных филаментных белков ламинов A и B1 в отдельных гомополимерах на ядерной оболочке, которые далее взаимодействуют друг с другом в структурах более высокого порядка. ^[18] Визуализация FLIM особенно полезна для нейронов, где рассеяние света мозговой тканью проблематично для ратиометрической визуализации. ^[19] В нейронах визуализация FLIM с использованием импульсного освещения использовалась для изучения белков семейства Ras , ^[20] CaMKII , Rac и Ran ^[21] . FLIM использовалась в клинической многофотонной томографии для обнаружения внутрикожных раковых клеток, а также фармацевтических и косметических соединений.

Совсем недавно FLIM также использовался для обнаружения флаванолов в растительных клетках. ^[22]

Автофлуоресцентные коферментыНАД(Ф)НиФАД

Многофотонная FLIM все чаще используется для обнаружения автофлуоресценции коферментов как маркеров изменений в метаболизме млекопитающих. ^{[23] [24]}

FRET-визуализация

Поскольку время жизни флуоресценции флуорофора зависит как от излучательных (т. е. флуоресценции), так и от неизлучательных (т. е. тушения, FRET) процессов, передача энергии от молекулы донора к молекуле акцептора уменьшит время жизни донора. Таким образом, измерения FRET с использованием FLIM могут предоставить метод для различения состояний/сред флуорофора. ^[25] В отличие от измерений FRET на основе интенсивности, измерения FRET на основе FLIM также нечувствительны к концентрации флуорофоров и, таким образом, могут отфильтровывать артефакты, вносимые изменениями концентрации и интенсивности излучения в образце.

Смотрите также

• Фазорный подход к измерению времени жизни флуоресценции и спектральной визуализации

Ссылки

1. Накабаяши, Такаказу; Ван, Хуэй-Пин; Кинджо, Масатака; Охта, Нобухиро (4 июня 2008 г.). «Применение визуализации времени жизни флуоресценции улучшенного зеленого флуоресцентного белка для внутриклеточных измерений pH». Photochemical & Photobiological Sciences . 7 (6): 668–670. doi :10.1039/B800391B. ISSN  1474-9092. PMID  18528549. S2CID  42881416.
2. Левитт, Джеймс А.; Куимова, Марина К.; Яхиоглу, Гохан; Чунг, Пей-Хуа; Сулинг, Клаус; Филлипс, Дэвид (9 июля 2009 г.). «Молекулярные роторы, связанные с мембраной, измеряют вязкость в живых клетках с помощью флуоресцентной визуализации времени жизни». Журнал физической химии C. 113 ( 27): 11634–11642. doi : 10.1021/jp9013493. hdl : 10044/1/15590 . ISSN  1932-7447. S2CID  96097931.
3. Руэдас-Рама, Мария Дж.; Орте, Энджел; Холл, Элизабет АХ; Альварес-Пез, Хосе М.; Талавера, Ева М. (20 февраля 2012 г.). «Наносенсор хлорид-ионов для флуориметрии с временным разрешением и визуализации времени жизни флуоресценции». Analyst . 137 (6): 1500–1508. Bibcode :2012Ana...137.1500R. doi :10.1039/C2AN15851E. ISSN  1364-5528. PMID  22324050.^{[ постоянная мертвая ссылка ]}
4. Агронская, Александра В.; Тертулен, Л.; Герритсен, Ханс К. (ноябрь 2004 г.). «Быстрая флуоресцентная визуализация кальция в живых клетках». Журнал биомедицинской оптики . 9 (6): 1230–1237. Bibcode : 2004JBO.....9.1230A. doi : 10.1117/1.1806472 . ISSN  1083-3668. PMID  15568944.
5. Джозеф Р. Лакович. Принципы флуоресцентной спектроскопии, 3-е издание. Springer (2006). ISBN 978-0387-31278-1 . ^{[ нужна страница ]} 
6. "SPC-150NX, Описание продукта". Becker & Hickl . Becker & Hickl GmbH. 26 апреля 2017 г. Получено 26 апреля 2017 г.
7. "PML-16, Описание продукта". Becker & Hickl . Becker & Hickl GmbH. 26 апреля 2017 г. Архивировано из оригинала 3 марта 2018 г. Получено 26 апреля 2017 г.
8. Ли, Дэй-Уэй; Арльт, Йохен; Ричардсон, Джастин; Уокер, Ричард; Батс, Алекс; Стоппа, Дэвид; Шарбон, Эдоардо; Хендерсон, Роберт (2010). «Система визуализации флуоресценции в реальном времени с матрицей лавинных диодов CMOS с малым количеством темных фотонов размером 32 × 32 0,13 мкм». Optics Express . 18 (10): 10257–69. Bibcode : 2010OExpr..1810257L. doi : 10.1364/OE.18.010257 . PMID  20588879.
9. Чанг, CW; Суд, D; Мичек, MA (2007). "Микроскопия изображений с длительностью флуоресценции" . Цифровая микроскопия, 3-е издание . Методы в клеточной биологии. Т. 81. С. 495–524. doi :10.1016/S0091-679X(06)81024-1. ISBN 9780123740250. PMID  17519182.
10. Elson, DS; Munro, I; Requejo-Isidro, J; McGinty, J; Dunsby, C; Galletly, N; Stamp, GW; Neil, MAA; Lever, MJ; Kellett, PA; Dymoke-Bradshaw, A; Hares, J; French, PMW (2004). "Визуализация флуоресценции во времени в реальном времени, включая получение одиночных снимков с помощью сегментированного оптического усилителя изображения". New Journal of Physics . 6 (1): 180. Bibcode :2004NJPh....6..180E. doi : 10.1088/1367-2630/6/1/180 . hdl : 10044/1/578 .
11. Сан, Инхуа; Хатами, Ниса; Йи, Мэтью; Марку, Дженнифер; Элсон, Дэниел С.; Горин, Фредрик; Шрот, Рудольф Дж.; Фиппс, Лора (2010). «Микроскопия флуоресцентной визуализации в течение всей жизни для хирургии опухолей головного мозга под контролем изображений» (PDF) . Журнал биомедицинской оптики . 15 (5): 056022–056022–5. Bibcode :2010JBO....15e6022S. doi :10.1117/1.3486612. PMC 2966493 . PMID  21054116. 
12. Гаделла, Теодор WJ (29 июля 2011 г.). Техники FRET и FLIM. Эльзевир. ISBN 978-0-08-091512-8.
13. Оида, Т.; Сако, И; Кусуми, А (1993). «Микроскопия флуоресцентной визуализации в течение жизни (флимскопия). Разработка методологии и применение к исследованиям слияния эндосом в отдельных клетках». Biophysical Journal . 64 (3): 676–85. Bibcode :1993BpJ....64..676O. doi :10.1016/S0006-3495(93)81427-9. PMC 1262380 . PMID  8471720. 
14. Лакович, Джозеф Р.; Шмацинский, Хенрик; Новачик, Казимеж; Берндт, Клаус В.; Джонсон, Майкл (1992). «Визуализация времени жизни флуоресценции». Аналитическая биохимия . 202 (2): 316–30. дои : 10.1016/0003-2697(92)90112-К. ПМК 6986422 . ПМИД  1519759. 
15. Lakowicz, Joseph R.; Szmacinski, H; Nowaczyk, K; Johnson, ML (1992). "Fluorescence Lifetime Imaging of Free and Protein-Bound NADH". Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (4): 1271–5. Bibcode :1992PNAS...89.1271L. doi : 10.1073/pnas.89.4.1271 . PMC 48431 . PMID  1741380. 
16. Wouters, Fred S.; Bastiaens, Philippe IH (1999). "Fluorescence lifelife imaging of receptor tyrosine kinase activity in cells". Current Biology . 9 (19): 1127–30. doi : 10.1016/S0960-9822(99)80484-9 . PMID  10531012. S2CID  7640970.
17. Verveer, Peter J.; Wouters, FS; Reynolds, AR; Bastiaens, PI (2000). «Количественная визуализация распространения сигнала латерального рецептора ErbB1 в плазматической мембране». Science . 290 (5496): 1567–70. Bibcode :2000Sci...290.1567V. doi :10.1126/science.290.5496.1567. PMID  11090353.
18. Delbarre, Erwan; Tramier, Marc; Coppey-Moisan, Maïté; Gaillard, Claire; Courvalin, Jean-Claude; Buendia, Brigitte (2006). «Усеченный преламин A при синдроме прогерии Хатчинсона–Гилфорда изменяет сегрегацию гомополимеров ламина A-типа и B-типа» (PDF) . Human Molecular Genetics . 15 (7): 1113–1122. doi : 10.1093/hmg/ddl026 . PMID  16481358.
19. Ясуда, Рёхей (2006). «Визуализация пространственно-временной динамики нейронной сигнализации с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции». Current Opinion in Neurobiology . 16 (5): 551–61. doi :10.1016/j.conb.2006.08.012. PMID  16971112. S2CID  54398436.
20. Харви, Кристофер Д.; Ясуда, Р.; Чжун, Х.; Свобода, К. (2008). «Распространение активности Ras, вызванное активацией одного дендритного шипика». Science . 321 (5885): 136–40. Bibcode :2008Sci...321..136H. doi :10.1126/science.1159675. PMC 2745709 . PMID  18556515. 
21. Калаб, Петр; Содерхольм, Йон (2010). «Разработка молекулярных сенсоров на основе резонансного переноса энергии (FRET) Фёрстера (флуоресценции) для Ran GTPase». Методы . 51 (2): 220–32. doi :10.1016/j.ymeth.2010.01.022. PMC 2884063. PMID  20096786 . 
22. Мюллер-Харви, Ирен; Фойхт, Вальтер; Польстер, Юрген; Трнкова, Люси; Бургос, Пьер; Паркер, Энтони В.; Ботчвэй, Стэнли В. (2012). «Двухфотонное возбуждение с пикосекундной визуализацией времени жизни флуоресценции для обнаружения ядерной ассоциации флаванолов». Analytica Chimica Acta . 719 : 68–75. doi :10.1016/j.aca.2011.12.068. PMID  22340533. S2CID  24094780.
23. Датта, Рупса; Альфонсо-Гарсия, Альба; Синко, Рэйчел; Граттон, Энрико (2015-05-20). "Флуоресцентная визуализация эндогенного биомаркера окислительного стресса в течение всего времени". Scientific Reports . 5 (1): 9848. doi :10.1038/srep09848. ISSN  2045-2322. PMC 4438616 . PMID  25993434. 
24. Cao, Ruofan; Wallrabe, Horst; Siller, Karsten; Periasamy, Ammasi (2020-02-05). "Оптимизация визуализации FLIM, подгонка и анализ для автофлуоресцентного NAD(P)H и FAD в клетках и тканях". Методы и приложения во флуоресценции . 8 (2): 024001. Bibcode : 2020MApFl...8b4001C. doi : 10.1088/2050-6120/ab6f25. ISSN  2050-6120. PMID  31972557. S2CID  210883495.
25. Беккер, Вольфганг; Бергманн, Аксель (2003). «Методы получения изображений в течение жизни для оптической микроскопии» (PDF) . стр. 4.

Внешние ссылки

• Флуоресцентная визуализация времени жизни возбужденного состояния
• Инструменты анализа времени жизни и спектрального анализа в ImageJ: http://spechron.com Архивировано 11.03.2013 на Wayback Machine
• Микроскопия флуоресцентной визуализации в течение жизни
• Принцип TCSPC FLIM (Becker&Hickl GmbH)