Сайт множественного клонирования ( MCS ), также называемый полилинкером , представляет собой короткий сегмент ДНК , содержащий множество (до ~20) сайтов рестрикции — стандартная особенность сконструированных плазмид . [1] Сайты рестрикции в MCS, как правило, уникальны и встречаются только один раз в пределах данной плазмиды. Целью MCS в плазмиде является обеспечение возможности вставки фрагмента ДНК в эту область. [2]
MCS встречается в различных векторах, включая векторы клонирования для увеличения количества копий целевой ДНК, а также в векторах экспрессии для создания белкового продукта. [3] В векторах экспрессии MCS располагается ниже промотора . [ 2]
В некоторых случаях вектор может не содержать MCS. Вместо этого MCS может быть добавлен к вектору. [4] Первым шагом является проектирование комплементарных олигонуклеотидных последовательностей, которые содержат сайты рестриктаз вместе с дополнительными основаниями на конце, которые комплементарны вектору после переваривания. Затем олигонуклеотидные последовательности можно отжигать и лигировать в переваренный и очищенный вектор. Переваренный вектор разрезают с помощью рестриктазы, которая дополняет выступы олигонуклеотидной вставки. После лигирования трансформируйте вектор в бактерии и проверьте вставку секвенированием. Этот метод также можно использовать для добавления новых сайтов рестрикции к сайту множественного клонирования.
Множественные сайты клонирования — это функция, которая позволяет вставлять чужеродную ДНК, не нарушая остальную часть плазмиды, что делает ее чрезвычайно полезной в биотехнологии , биоинженерии и молекулярной генетике . [1] MCS может помочь в создании трансгенных организмов, более известных как генетически модифицированные организмы (ГМО), с помощью генной инженерии. Чтобы воспользоваться преимуществами MCS в генной инженерии, интересующий ген должен быть добавлен к вектору во время производства, когда MCS разрезается. [5] После того, как MCS будет создан и лигирован, он будет включать интересующий ген и может быть амплифицирован для увеличения числа копий гена в бактерии-хозяине. После репликации бактерии интересующий ген может быть извлечен из бактерии. В некоторых случаях вектор экспрессии может быть использован для создания белкового продукта. После того, как продукты выделены, они имеют широкий спектр применения, например, производство инсулина , создание вакцин , производство антибиотиков и создание генной терапии.
Одной из бактериальных плазмид, используемых в генной инженерии в качестве вектора клонирования плазмиды, является pUC18. Ее полилинкерная область состоит из нескольких сайтов распознавания рестриктаз, которые были сконструированы в один кластер (полилинкер). Она имеет сайты рестрикции для различных рестриктаз, включая EcoRI , BamHI и PstI . Другим вектором, используемым в генной инженерии, является pUC19 , который похож на pUC18, но его полилинкерная область обращена. E.coli также часто используется в качестве бактериального хозяина из-за доступности, быстрой скорости роста и универсальности. [6] Примером вектора клонирования плазмиды, который модифицирует вставленный белок, является плазмида pFUSE-Fc.
Для того чтобы генетически сконструировать инсулин, первым шагом является разрезание MCS в используемой плазмиде. [7] После разрезания MCS можно добавить ген человеческого инсулина, сделав плазмиду генетически модифицированной. После этого генетически модифицированную плазмиду помещают в бактериальный хозяин и позволяют ей делиться. Чтобы создать большой запас, который требуется, клетки хозяина помещают в большой ферментационный резервуар, который является оптимальной средой для хозяина. Процесс завершается фильтрацией инсулина из хозяина. Затем можно провести очистку, чтобы инсулин можно было упаковать и распределить среди людей с диабетом.
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )