Первичный транскрипт — это продукт одноцепочечной рибонуклеиновой кислоты ( РНК ) , синтезируемый путем транскрипции ДНК и обрабатываемый с получением различных зрелых продуктов РНК, таких как мРНК , тРНК и рРНК . Первичные транскрипты, называемые мРНК, модифицируются при подготовке к трансляции . Например, мРНК-предшественник ( пре-мРНК ) представляет собой тип первичного транскрипта, который после процессинга становится информационной РНК (мРНК) .
Пре-мРНК синтезируется из матрицы ДНК в ядре клетки путем транскрипции . Пре-мРНК включает большую часть гетерогенной ядерной РНК ( гнРНК ). После того как пре-мРНК полностью процессирована , ее называют « зрелой информационной РНК » или просто « мессенджерной РНК ». Термин hnRNA часто используется как синоним пре-мРНК, хотя, в строгом смысле, hnRNA может включать транскрипты ядерной РНК, которые не превращаются в цитоплазматическую мРНК.
Существует несколько этапов, способствующих созданию первичных транскриптов. Все эти шаги включают серию взаимодействий, которые инициируют и завершают транскрипцию ДНК в ядре эукариот . Определенные факторы играют ключевую роль в активации и ингибировании транскрипции, регулируя выработку первичных транскриптов. Транскрипция производит первичные транскрипты, которые в дальнейшем модифицируются несколькими процессами. Эти процессы включают 5'-кэп , 3'-полиаденилирование и альтернативный сплайсинг . В частности, альтернативный сплайсинг напрямую способствует разнообразию мРНК, обнаруживаемой в клетках. Модификации первичных транскриптов были дополнительно изучены в исследованиях, направленных на более глубокое знание роли и значения этих транскриптов. Экспериментальные исследования, основанные на молекулярных изменениях первичных транскриптов и процессах до и после транскрипции, привели к лучшему пониманию заболеваний, связанных с первичными транскриптами.
Шаги, способствующие производству первичных транскриптов, включают серию молекулярных взаимодействий, которые инициируют транскрипцию ДНК внутри ядра клетки. В зависимости от потребностей данной клетки определенные последовательности ДНК транскрибируются для получения различных продуктов РНК, которые транслируются в функциональные белки для клеточного использования. Чтобы инициировать процесс транскрипции в ядре клетки, двойные спирали ДНК раскручиваются, а водородные связи , соединяющие совместимые нуклеиновые кислоты ДНК, разрываются, образуя две несвязанные одиночные цепи ДНК. [1] Одна цепь ДНК-матрицы используется для транскрипции мРНК одноцепочечного первичного транскрипта. Эта цепь ДНК связана РНК-полимеразой в промоторной области ДНК. [2]
У эукариот три вида РНК — рРНК , тРНК и мРНК — производятся на основе активности трех различных РНК-полимераз, тогда как у прокариот существует только одна РНК-полимераза для создания всех типов молекул РНК. [3] РНК-полимераза II эукариот транскрибирует первичный транскрипт, транскрипт, предназначенный для процессинга в мРНК, с антисмысловой матрицы ДНК в направлении от 5' к 3', и этот вновь синтезированный первичный транскрипт комплементарен антисмысловой цепи ДНК. . [1] РНК-полимераза II конструирует первичный транскрипт, используя набор из четырех специфических остатков рибонуклеозидмонофосфата ( аденозинмонофосфат ( AMP), цитидинмонофосфат (CMP), гуанозинмонофосфат (GMP) и уридинмонофосфат (UMP)), которые непрерывно добавляются к 3'-гидроксильная группа на 3'-конце растущей мРНК. [1]
Исследования первичных транскриптов, продуцируемых РНК-полимеразой II, показывают, что средняя длина первичного транскрипта составляет 7000 нуклеотидов , а некоторые достигают длины 20 000 нуклеотидов. [2] Включение последовательностей экзонов и интронов в первичные транскрипты объясняет разницу в размерах между более крупными первичными транскриптами и меньшими, зрелыми мРНК, готовыми к трансляции в белок.
Ряд факторов способствуют активации и ингибированию транскрипции и, следовательно, регулируют продукцию первичных транскриптов из данной матрицы ДНК.
Активация активности РНК-полимеразы для производства первичных транскриптов часто контролируется последовательностями ДНК, называемыми энхансерами . Факторы транскрипции — белки, которые связываются с элементами ДНК, активируя или подавляя транскрипцию, связываются с энхансерами и рекрутируют ферменты, которые изменяют компоненты нуклеосомы , в результате чего ДНК становится более или менее доступной для РНК-полимеразы. Уникальные комбинации активирующих или ингибирующих факторов транскрипции, которые связываются с областями ДНК энхансера, определяют, активируется ли ген, с которым взаимодействует энхансер, для транскрипции или нет. [4] Активация транскрипции зависит от того, может ли комплекс элонгации транскрипции, который сам состоит из множества факторов транскрипции, индуцировать диссоциацию РНК-полимеразы от комплекса медиатора , который соединяет энхансерную область с промотором. [4]
Ингибирование активности РНК-полимеразы также может регулироваться последовательностями ДНК, называемыми сайленсерами . Как и энхансеры, сайленсеры могут располагаться дальше или ниже от генов, которые они регулируют. Эти последовательности ДНК связываются с факторами, которые способствуют дестабилизации комплекса инициации, необходимого для активации РНК-полимеразы, и, следовательно, ингибируют транскрипцию. [5]
Модификация гистонов факторами транскрипции является еще одним ключевым регуляторным фактором транскрипции РНК-полимеразой. В целом факторы, которые приводят к ацетилированию гистонов , активируют транскрипцию, тогда как факторы, которые приводят к деацетилированию гистонов , ингибируют транскрипцию. [6] Ацетилирование гистонов вызывает отталкивание между отрицательными компонентами внутри нуклеосом, обеспечивая доступ РНК-полимеразы. Деацетилирование гистонов стабилизирует плотно скрученные нуклеосомы, ингибируя доступ РНК-полимеразы. Помимо паттернов ацетилирования гистонов, паттерны метилирования промоторных областей ДНК могут регулировать доступ РНК-полимеразы к данной матрице. РНК-полимераза часто неспособна синтезировать первичный транскрипт, если область промотора целевого гена содержит специфические метилированные цитозины — остатки, которые препятствуют связыванию факторов, активирующих транскрипцию, и привлекают другие ферменты для стабилизации прочно связанной структуры нуклеосомы, исключая доступ РНК-полимеразы и предотвращая производство первичных транскриптов. [4]
R-петли образуются во время транскрипции. R-петля представляет собой трехцепочечную структуру нуклеиновой кислоты, содержащую гибридную область ДНК-РНК и связанную с ней нематричную одноцепочечную ДНК. Активно транскрибируемые участки ДНК часто образуют R-петли, уязвимые для повреждения ДНК . Интроны уменьшают образование R-петли и повреждение ДНК в высокоэкспрессируемых генах дрожжей. [7]
Транскрипция, строго регулируемая фаза экспрессии генов, производит первичные транскрипты. Однако транскрипция — это только первый шаг, за которым должно последовать множество модификаций, приводящих к появлению функциональных форм РНК. [8] Другими словами, вновь синтезированные первичные транскрипты модифицируются несколькими способами для преобразования в их зрелые функциональные формы для производства различных белков и РНК, таких как мРНК, тРНК и рРНК.
Основной процесс модификации первичного транскрипта одинаков для тРНК и рРНК как в эукариотических, так и в прокариотических клетках. С другой стороны, процессинг первичного транскрипта различается в мРНК прокариотических и эукариотических клеток. [8] Например, некоторые прокариотические бактериальные мРНК служат матрицами для синтеза белков, в то же время они производятся посредством транскрипции. Альтернативно, пре-мРНК эукариотических клеток претерпевают широкий спектр модификаций перед транспортировкой из ядра в цитоплазму, где транслируются их зрелые формы. [8] Эти модификации отвечают за разные типы закодированных сообщений, которые приводят к переводу различных типов продуктов. Более того, обработка первичных транскриптов обеспечивает контроль экспрессии генов, а также механизм регуляции скорости деградации мРНК. Процессинг пре-мРНК в эукариотических клетках включает 5'-кэпирование , 3'-полиаденилирование и альтернативный сплайсинг .
Вскоре после инициации транскрипции у эукариот 5'-конец пре-мРНК модифицируется путем добавления 7-метилгуанозинового кэпа , также известного как 5'-кэп. [8] Модификация 5'-кэпирования инициируется добавлением GTP к 5'-концевому нуклеотиду пре-мРНК в обратной ориентации с последующим добавлением метильных групп к остатку G. [8] 5'-кэпирование необходимо для производства функциональных мРНК, поскольку 5'-кэп отвечает за выравнивание мРНК с рибосомой во время трансляции. [8]
У эукариот полиаденилирование дополнительно модифицирует пре-мРНК, во время чего добавляется структура, называемая поли-А-хвостом . [8] Сигналы полиаденилирования, которые включают несколько элементов последовательности РНК, обнаруживаются группой белков, которые сигнализируют о добавлении поли-А-хвоста (длиной около 200 нуклеотидов). Реакция полиаденилирования дает сигнал об окончании транскрипции, и эта реакция заканчивается примерно на несколько сотен нуклеотидов ниже места расположения хвоста поли-А. [8]
Интроны эукариотических пре-мРНК соединены сплайсосомами , состоящими из небольших ядерных рибонуклеопротеинов . [9] [10]
В сложных эукариотических клетках один первичный транскрипт способен синтезировать большое количество зрелых мРНК за счет альтернативного сплайсинга. Альтернативный сплайсинг регулируется таким образом, что каждая зрелая мРНК может кодировать множество белков.
Эффект альтернативного сплайсинга в экспрессии генов можно увидеть у сложных эукариот, которые имеют фиксированное количество генов в своем геноме, но производят гораздо большее количество различных генных продуктов. [8] Большинство эукариотических транскриптов пре-мРНК содержат множество интронов и экзонов. Различные возможные комбинации 5'- и 3'-сайтов сплайсинга в пре-мРНК могут приводить к различному вырезанию и комбинации экзонов, в то время как интроны удаляются из зрелой мРНК. Таким образом, образуются различные виды зрелых мРНК. [8] Альтернативный сплайсинг происходит в большом белковом комплексе, называемом сплайсосомой . Альтернативный сплайсинг имеет решающее значение для тканеспецифической регуляции экспрессии генов и регуляции развития. [8] На альтернативный сплайсинг могут влиять различные факторы, включая такие мутации, как хромосомная транслокация .
У прокариот сплайсинг осуществляется путем автокаталитического или эндолитического расщепления. Автокаталитическое расщепление, в котором не участвуют белки, обычно зарезервировано для участков, кодирующих рРНК, тогда как эндолитическое расщепление соответствует предшественникам тРНК.
Исследование Синди Л. Уиллс и Брюса Дж. Дольника из отдела экспериментальной терапии Комплексного онкологического центра Розуэлл-Парк (тогда известного как Мемориальный институт Розуэлл-Парк) в Буффало, штат Нью-Йорк, а также из программы клеточной и молекулярной биологии Университета Висконсин в Мэдисоне, штат Висконсин, был создан для понимания клеточных процессов, включающих первичные транскрипты. Исследователи хотели понять, ингибирует ли 5- фторурацил (FUra), препарат, известный для лечения рака, или останавливает процессинг пре-мРНК дигидрофолатредуктазы (DHFR) и/или стабильность ядерной мРНК в клетках KB, устойчивых к метотрексату . Длительное воздействие FUra не оказало влияния на уровень пре-мРНК DHFR, содержащей определенные интроны, которые представляют собой участки пре-мРНК, которые обычно вырезаются из последовательности в ходе процессинга. Однако уровни общей мРНК DHFR снижались в два раза в клетках, подвергнутых воздействию 1,0 мкМ FUra. Не наблюдалось существенных изменений в периоде полураспада , который относится к времени, которое требуется для распада 50% мРНК от общего количества мРНК DHFR или пре-мРНК, наблюдаемых в клетках, подвергшихся воздействию FUra. Эксперименты по мечению ядерной/цитоплазматической РНК показали, что скорость изменения ядерной РНК DHFR на цитоплазматическую мРНК DHFR снижается в клетках, обработанных FUra. Эти результаты предоставляют дополнительные доказательства того, что FUra может способствовать процессингу предшественников мРНК и/или влиять на стабильность мРНК ядерного DHFR. [11]
Джудит Ленгиел и Шелдон Пенман с кафедры биологии Массачусетского технологического института (MIT) в Кембридже, штат Массачусетс, написали статью об одном типе первичного транскрипта, вовлеченного в гены двух двукрылых , или насекомых, имеющих два крыла: Drosophila и Aedes . . В статье описывается, как исследователи изучали первичные транскрипты гнРНК или, по сути, пре-мРНК у двух видов насекомых. Сравнивали размер транскриптов гнРНК и долю гнРНК, которая превращается в мРНК в клеточных линиях или группах клеток, полученных из одной изучаемой клетки Drosophila melanogaster и Aedes albopictus . Оба насекомые являются двукрылыми, но геном Aedes больше, чем у дрозофилы . Это означает, что у Aedes больше ДНК, а значит, и больше генов. Линия Aedes производит более крупные гнРНК, чем линия Drosophila , хотя обе клеточные линии росли в сходных условиях и продуцировали зрелую или процессированную мРНК одинакового размера и сложности последовательности. Эти данные позволяют предположить, что размер гнРНК увеличивается с увеличением размера генома, что очевидно демонстрирует Aedes. [12]
Иво Мелчак, Степанка Мелчакова, Войтех Копски, Яромира Весерова и Иван Рашка из отдела клеточной биологии Института экспериментальной медицины Академии наук Чешской Республики в Праге изучали влияние ядерных спеклов на пре-мРНК. Ядерные спеклы (спеклы) входят в состав ядер клеток и обогащены факторами сплайсинга , известными своим участием в процессинге мРНК. Было показано, что ядерные спеклы служат соседним активным генам местами хранения этих факторов сплайсинга. В этом исследовании исследователи показали, что в клетках HeLa, которые произошли от клеток человека, перенесшего рак шейки матки, и оказались полезными для экспериментов, первая группа сплайсосом на пре-мРНК происходит из этих пятен. Исследователи использовали микроинъекции сплайсосомо-акцепторных и мутантных пре-мРНК аденовируса с дифференциальным связыванием факторов сплайсинга, чтобы создать разные группы, а затем проследили за сайтами, в которых они были в большом количестве. Пре-мРНК, принимающие сплайсосому, быстро были направлены в спеклы, но было обнаружено, что это направление зависит от температуры. Последовательности полипиримидинового тракта в мРНК способствуют построению групп сплайсосом и необходимы для нацеливания, но сами по себе недостаточны. Нижние фланкирующие последовательности были особенно важны для нацеливания мутантных пре-мРНК в спеклы. В вспомогательных экспериментах за поведением спеклов следили после микроинъекции антисмысловых дезоксиолигорибонуклеотидов (комплементарных последовательностей ДНК и/или РНК определенной последовательности) и, в данном случае, специфических последовательностей мяРНК . Известно, что мяРНК также помогают в процессинге пре-мРНК. В этих условиях на эндогенных пре-мРНК образуются группы сплайсосом. Исследователи пришли к выводу, что группы сплайсосом на микроинъецированной пре-мРНК формируются внутри спеклов. Нацеливание и накопление пре-мРНК в спеклах является результатом загрузки факторов сплайсинга в пре-мРНК, а группы сплайсосом приводят к наблюдаемому крапчатому паттерну. [13]
Исследования также привели к расширению знаний об определенных заболеваниях, связанных с изменениями в первичных транскриптах. Одно исследование касалось рецепторов эстрогена и дифференциального сплайсинга. В статье под названием «Альтернативный сплайсинг первичного транскрипта альфа-рецептора эстрогена человека: механизмы пропуска экзона» Паолы Ферро, Алессандры Форлани, Марко Муселли и Ульриха Пфеффера из лаборатории молекулярной онкологии Национального института исследования рака в Генуе, Италия, объясняется что 1785 нуклеотидов участка ДНК, кодирующего альфа-рецептор эстрогена (ER-альфа), распределены по участку, который содержит более 300 000 нуклеотидов в первичном транскрипте. Сплайсинг этой пре-мРНК часто приводит к появлению вариантов или разных видов мРНК, в которых отсутствует один или несколько экзонов или областей, необходимых для кодирования белков. Эти варианты были связаны с прогрессированием рака молочной железы . [14] В жизненном цикле ретровирусов провирусная ДНК включается в транскрипцию ДНК инфицированной клетки. Поскольку ретровирусам необходимо изменить свою пре-мРНК на ДНК, чтобы эта ДНК могла быть интегрирована в ДНК хозяина, на которого она воздействует, формирование этой матрицы ДНК является жизненно важным шагом для репликации ретровируса. Тип клетки, дифференцировка или измененное состояние клетки и физиологическое состояние клетки приводят к значительному изменению доступности и активности определенных факторов, необходимых для транскрипции. Эти переменные создают широкий спектр экспрессии вирусных генов. Например, клетки культуры ткани, активно продуцирующие инфекционные вирионы вирусов птичьего или мышиного лейкоза (ASLV или MLV), содержат настолько высокие уровни вирусной РНК, что 5–10% мРНК в клетке могут иметь вирусное происхождение. Это показывает, что первичные транскрипты, продуцируемые этими ретровирусами, не всегда следуют нормальному пути производства белка и конвертируются обратно в ДНК для размножения и расширения. [15]