Нативная химическая лигация (НХЛ) является важным расширением концепции химической лигации для построения более крупной полипептидной цепи путем ковалентной конденсации двух или более незащищенных пептидных сегментов. [1] Нативная химическая лигация является наиболее эффективным методом синтеза нативных или модифицированных белков типичного размера ( т. е . белков < ~300 АК). [2]
В нативном химическом лигировании ионизированная тиольная группа N-концевого остатка цистеина незащищенного пептида атакует C-концевой тиоэстер второго незащищенного пептида в водном буфере при pH 7,0 и комнатной температуре. Этот этап транстиоэтерификации обратим в присутствии арилтиольного катализатора, что делает реакцию как хемоселективной, так и региоселективной, и приводит к образованию промежуточного соединения, связанного с тиоэстером. Промежуточное соединение быстро и спонтанно перестраивается посредством внутримолекулярного S,N-ацильного сдвига , что приводит к образованию нативной амидной (« пептидной ») связи в месте лигирования (схема 1).
Замечания:
Начальный этап транстиоэтерификации реакции нативного химического лигирования катализируется тиоловыми добавками. Наиболее эффективным и часто используемым тиоловым катализатором является 4-меркаптофенилуксусная кислота (MPAA), (ссылка).
Ключевой особенностью нативного химического лигирования незащищенных пептидов является обратимость первого шага , реакции обмена тиол(ат)-тиоэфир. Нативное химическое лигирование является исключительно региоселективным, поскольку этот шаг обмена тиол(ат)-тиоэфир свободно обратим в присутствии добавленного арилтиольного катализатора. Высокие выходы конечного продукта лигирования, полученные даже в присутствии внутренних остатков Cys в одном/обоих сегментах, являются результатом необратимости второго (сдвиг ацила S-в-N) шага образования амида в используемых условиях реакции.
В результате реакции с другими функциональными группами, присутствующими в любом из сегментов пептида (например, карбоновыми кислотами боковой цепи Asp, Glu; эпсилон-аминогруппой Lys; фенольным гидроксилом Tyr; гидроксилами Ser, Thr и т. д.) не образуются побочные продукты.
В 1992 году Стивен Кент и Мартина Шнёльцер из Научно-исследовательского института Скриппса разработали концепцию «Химического лигирования» — первый практический метод ковалентной конденсации незащищенных пептидных сегментов; ключевой особенностью химического лигирования является образование неестественной связи в месте лигирования. Всего два года спустя, в 1994 году, Филип Доусон, Том Мьюир и Стивен Кент сообщили о «Нейтивном химическом лигировании», расширении концепции химического лигирования до образования нативной амидной («пептидной») связи после того, как начальная нуклеофильная конденсация образовала тиоэфир-связанный продукт конденсации, предназначенный для спонтанной перестройки в нативную амидную связь в месте лигирования.
Теодор Виланд и его коллеги сообщили о сдвиге ацила S-в-N еще в 1953 году, когда было показано, что реакция тиоэфира валина и аминокислоты цистеина в водном буфере дает дипептид валин-цистеин. [3] Реакция протекала через промежуточное звено тиоэфира, содержащего серу остатка цистеина. Однако работа Виланда НЕ привела к разработке нативной химической реакции лигирования. Скорее, изучение реакций тиоэфира аминокислоты привело Виланда и других к разработке метода «активного эфира» для синтеза защищенных пептидных сегментов обычными химическими методами, проводимыми в органических растворителях.
Нативная химическая лигация является основой современного химического синтеза белков и использовалась для получения многочисленных белков и ферментов путем полного химического синтеза. Выгода метода нативной химической лигации заключается в том, что связывание длинных пептидов с помощью этой техники обычно близко к количественному и обеспечивает синтетический доступ к большим пептидам и белкам, которые в противном случае невозможно было бы получить из-за их большого размера, декорирования посттрансляционной модификацией и содержания некодированных аминокислот или других химических строительных блоков.
Нативная химическая лигация по своей сути «зеленая» в плане экономии атомов и использования безопасных растворителей. Она включает реакцию незащищенного пептидного тиоэфира со вторым незащищенным пептидом, имеющим остаток цистеина на N-конце. Она проводится в водном растворе при нейтральном pH, обычно в 6 M гуанидингидрохлориде, в присутствии арилтиольного катализатора и обычно дает почти количественные выходы желаемого продукта лигирования.
Пептид-тиоэфиры могут быть получены напрямую с помощью Boc-химии SPPS ; однако пептиды, содержащие тиоэфир, нестабильны при обработке нуклеофильным основанием, что препятствует прямому синтезу пептидных тиоэфиров с помощью Fmoc-химии SPPS . Методы твердофазного пептидного синтеза с помощью Fmoc-химии для получения пептидных тиоэфиров основаны на синтезе пептидных гидразидов, которые преобразуются в пептидные тиоэфиры постсинтетически.
Полипептидные C-концевые тиоэфиры также могут быть получены in situ , используя так называемые системы сдвига N,S -ацила. Группа бис (2-сульфанилэтил)амидо, также называемая группой SEA, принадлежит к этому семейству. Полипептидные C-концевые бис (2-сульфанилэтил)амиды (пептидные сегменты SEA) реагируют с пептидом Cys, образуя нативную пептидную связь, как в NCL. Эта реакция, которая называется лигированием нативного пептида SEA , является полезным вариантом нативного химического лигирования. [4]
При создании пептидных сегментов, содержащих остаток цистеина N-конца, следует избегать воздействия кетонов, поскольку они могут заблокировать цистеин N-конца. Не используйте защитные группы, которые высвобождают альдегиды или кетоны . По той же причине следует избегать использования ацетона , особенно при мытье стеклянной посуды, используемой для лиофилизации .
Особенностью метода нативного химического лигирования является то, что полипептидная цепь продукта содержит цистеин в месте лигирования. Цистеин в месте лигирования может быть десульфирован до аланина , таким образом расширяя диапазон возможных мест лигирования, включая остатки аланина. Другие аминокислоты, содержащие бета-тиол, могут быть использованы для нативного химического лигирования с последующей десульфуризацией. В качестве альтернативы могут быть использованы вспомогательные вещества лигирования, содержащие тиол, которые имитируют N-концевой цистеин для реакции лигирования, но которые могут быть удалены после синтеза. Использование вспомогательных веществ, содержащих тиол, может быть не таким эффективным, как лигирование по остатку Cys. Нативное химическое лигирование также может быть выполнено с N-концевым остатком селеноцистеина. [5]
Полипептидные C-концевые тиоэфиры, полученные с помощью методов рекомбинантной ДНК, могут реагировать с N-концевым цистеином, содержащим полипептид, с помощью той же самой нативной химии лигирования, чтобы обеспечить очень большие полусинтетические белки. Нативное химическое лигирование такого рода с использованием рекомбинантного полипептидного сегмента известно как лигирование экспрессированного белка. Аналогично, рекомбинантный белок, содержащий N-концевой цистеин, может реагировать с синтетическим полипептидным тиоэфиром . Таким образом, нативное химическое лигирование может использоваться для введения химически синтезированных сегментов в рекомбинантные белки, независимо от размера.
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )