stringtranslate.com

Иммунофлюоресценция

Сосудистая сеть свиной кожи при флуоресценции ( гладкомышечный актин с AlexaFluor 488). Зеленый = гладкомышечный актин (SMA) с флуорофором Alexa 488. Синий = контрастное окрашивание DAPI. Красный = автофлуоресценция.

Иммунофлуоресценция (ИФ) — это метод, основанный на световой микроскопии , который позволяет обнаруживать и локализовать широкий спектр целевых биомолекул в клетке или ткани на количественном уровне. Метод использует специфичность связывания антител и антигенов . [1] Конкретная область, которую антитело распознает на антигене, называется эпитопом . Несколько антител могут распознавать один и тот же эпитоп, но различаться по своей связывающей аффинности. Антитело с более высокой аффинностью к определенному эпитопу превзойдет антитела с более низкой аффинностью к тому же эпитопу. [2] [3]

При конъюгации антитела с флуорофором положение целевой биомолекулы визуализируется путем возбуждения флуорофора и измерения испускания света на определенной предопределенной длине волны с использованием флуоресцентного микроскопа . Крайне важно, чтобы связывание флуорофора с самим антителом не влияло на иммунологическую специфичность антитела или связывающую способность его антигена. [4] [5]

Иммунофлуоресценция является широко используемым примером иммуноокрашивания (использование антител для окрашивания белков) и является конкретным примером иммуногистохимии (использование взаимосвязи антитело-антиген в тканях). Этот метод в первую очередь использует флуорофоры для визуализации местоположения антител, в то время как другие вызывают изменение цвета в среде, содержащей интересующий антиген, или используют радиоактивную метку. Иммунофлуоресцентные методы, которые использовали меченые антитела, были концептуализированы в 1940-х годах Альбертом Х. Кунсом . [2] [6] [7]

Микрофотография гистологического среза кожи человека, подготовленного для прямой иммунофлуоресценции с использованием антитела анти-IgG. Кожа принадлежит пациенту с системной красной волчанкой и показывает отложение IgG в двух разных местах: первое — это полосовидное отложение вдоль эпидермальной базальной мембраны (тест на волчаночную полосу положительный). Второе — внутри ядер эпидермальных клеток (антинуклеарные антитела).

Иммунофлуоресценция используется в фундаментальных научных исследованиях и клинических диагностических начинаниях, демонстрируя свою многогранную полезность в различных субстратах, включая срезы тканей, культивируемые клеточные линии или отдельные клетки. Ее использование включает анализ распределения белков , гликанов , небольших биологических и небиологических молекул и визуализацию структур, таких как нити среднего размера. [8]

Если топология клеточной мембраны не определена, вставка эпитопа в белки может использоваться в сочетании с иммунофлуоресценцией для определения структур внутри клеточной мембраны. [9] Иммунофлуоресценция (ИФ) также может использоваться как «полуколичественный» метод для получения информации об уровнях и локализации схем метилирования ДНК. ИФ может дополнительно использоваться в сочетании с другими, неантителными методами флуоресцентного окрашивания, например, с использованием DAPI для маркировки ДНК . [10] [11]

Исследование образцов иммунофлуоресценции можно проводить с использованием различных конфигураций микроскопа, включая эпифлуоресцентный микроскоп , конфокальный микроскоп и широкопольный микроскоп. [12]

Типы

Основные паттерны антинуклеарных антител при иммунофлюоресценции. [13]

Приготовление флуоресценции

Для проведения иммунофлуоресцентного окрашивания флуорофор должен быть конъюгирован («помечен») с антителом. Процедуры окрашивания могут применяться как к удерживаемым внутриклеточно экспрессированным антителам, так и к антигенам клеточной поверхности на живых клетках. Существует два общих класса иммунофлуоресцентных методов: первичные (прямые) и вторичные (непрямые). [1] [2] Следующие описания будут сосредоточены в первую очередь на этих классах с точки зрения конъюгированных антител. [12]

Первичный (прямой)

Основная концепция первичной иммунофлуоресценции : антитело с конъюгированным флуорофором, которое специфически связывается с эпитопом на целевой молекуле.

Первичная (прямая) иммунофлуоресценция (DIF) использует одно антитело, конъюгированное с флуорофором . Антитело распознает целевую молекулу (антиген) и связывается с определенной областью, называемой эпитопом . Прикрепленный флуорофор можно обнаружить с помощью флуоресцентной микроскопии, которая, в зависимости от типа флуорофора, будет излучать определенную длину волны света после возбуждения. [1] [14]

Прямое присоединение флуорофора к антителу сокращает количество этапов в процедуре подготовки образца, экономя время и уменьшая неспецифический фоновый сигнал во время анализа. [12] Это также ограничивает возможность перекрестной реактивности антител и возможные ошибки на протяжении всего процесса. Одним из недостатков DIF является ограниченное количество антител, которые могут связываться с антигеном. Это ограничение может снизить чувствительность метода. Когда целевой белок доступен только в небольших концентрациях, лучшим подходом будет вторичная IF, которая считается более чувствительной, чем DIF [2] [12] по сравнению со вторичной (непрямой) иммунофлуоресценцией. [1]

Основная концепция вторичной иммунофлуоресценции : вторичное антитело с конъюгированным флуорофором, связанное с первичным антителом, которое специфически связывается с эпитопом на целевой молекуле.

Вторичный (косвенный)

Вторичная (непрямая) иммунофлуоресценция (SIF) похожа на прямую иммунофлуоресценцию, однако в этой технике используются два типа антител, тогда как только один из них имеет конъюгированный флуорофор. Антитело с конъюгированным флуорофором называется вторичным антителом, а неконъюгированное — первичным антителом. [1]

Принцип этого метода заключается в том, что первичное антитело специфически связывается с эпитопом на целевой молекуле, тогда как вторичное антитело с конъюгированным флуорофором распознает первичное антитело и связывается с ним. [1]  

Этот метод считается более чувствительным, чем первичная иммунофлуоресценция, поскольку несколько вторичных антител могут связываться с одним и тем же первичным антителом. Увеличенное количество молекул флуорофора на антиген увеличивает количество испускаемого света и, таким образом, усиливает сигнал. [1] Существуют различные методы достижения более высокого соотношения флуорофор-антиген, такие как комплекс авидина и биотина (метод ABC) и меченый стрептавидин-биотин (метод LSAB). [15] [16]

Ограничения

Основная концепция метода ABC : Первичное антитело связывается с антигеном, перед связыванием с биотинилированным вторичным антителом. Затем ферментный комплекс авидин-биотин (ABC) присоединяется к вторичному антителу.

Иммунофлуоресценция ограничивается только фиксированными (т. е. мертвыми) клетками при изучении структур внутри клетки, поскольку антитела обычно не проникают через неповрежденные клеточные или субклеточные мембраны в живых клетках, поскольку они представляют собой большие белки. Для визуализации этих структур антигенный материал должен быть прочно зафиксирован на своей естественной локализации внутри клетки. [17] Для изучения структур внутри живых клеток в сочетании с флуоресценцией можно использовать рекомбинантные белки, содержащие домены флуоресцентных белков, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP). Метод GFP подразумевает изменение генетической информации клеток. [18] [19]

Значительной проблемой иммунофлуоресценции является фотообесцвечивание [12], постоянная потеря способности флуорофоров излучать свет. [1] Для снижения риска фотообесцвечивания можно использовать различные стратегии. Уменьшая или ограничивая интенсивность или временной интервал воздействия света, цикл поглощения-излучения флуоресцентного света уменьшается, тем самым сохраняя функциональность флуорофоров. Можно также увеличить концентрацию флуорофоров или выбрать более надежные флуорофоры, которые демонстрируют устойчивость к фотообесцвечиванию, такие как Alexa Fluors , Seta Fluors или DyLight Fluors . [2]

Основная концепция метода LSAB : использует конъюгат стрептавидина и фермента для идентификации биотинилированного вторичного антитела, связанного с первичным антителом. Этот подход применим, когда комплекс авидина и биотина в методе ABC становится слишком большим.

Другие проблемы, которые могут возникнуть при использовании методов иммунофлуоресценции, включают автофлуоресценцию , спектральное перекрытие и неспецифическое окрашивание. [1] [2] Автофлуоресценция включает естественную флуоресценцию, испускаемую самой тканью или клеткой образца. Спектральное перекрытие происходит, когда флуорофор имеет широкий спектр излучения, который перекрывается со спектром другого флуорофора, тем самым вызывая ложные сигналы. Неспецифическое окрашивание происходит, когда антитело, содержащее флуорофор, связывается с непреднамеренными белками из-за достаточного сходства в эпитопе. Это может привести к ложным положительным результатам. [2] [4] [1]

Авансы

Основные усовершенствования иммунофлуоресценции заключаются в разработке флуорофоров и флуоресцентных микроскопов. Флуорофоры могут быть структурно модифицированы для улучшения яркости и фотостабильности, сохраняя при этом спектральные свойства и проницаемость клеток. [20]

Микрофотография гистологического среза кожи человека, подготовленного для прямой иммунофлуоресценции с использованием антитела против IgA. Кожа пациента с пурпурой Шенлейна-Геноха : отложения IgA обнаружены в стенках мелких поверхностных капилляров (желтые стрелки). Бледно-волнистая зеленая область сверху — эпидермис , нижняя фиброзная область — дерма .

Методы флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения могут создавать изображения с более высоким разрешением, чем те микроскопы, которые накладываются дифракционным пределом . Это позволяет определять структурные детали внутри клетки. [21] Сверхразрешение во флуоресценции, более конкретно, относится к способности микроскопа предотвращать одновременную флуоресценцию соседних спектрально идентичных флуорофоров (спектральное перекрытие). Некоторые из недавно разработанных методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения включают микроскопию с истощением стимулированного излучения ( STED ), микроскопию с насыщенным структурированным освещением (SSIM), микроскопию локализации фотоактивации флуоресценции (F PALM ) и микроскопию стохастической оптической реконструкции (STORM). [22]

Известные люди

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abcdefghij Оделл ID, Кук D (2013-01-01). "Методы иммунофлуоресценции". Журнал исследовательской дерматологии . 133 (1): e4. doi : 10.1038/jid.2012.455 . PMID  23299451.
  2. ^ abcdefg Джоши С., Ю Д. (2017), «Иммунофлюоресценция», Методы фундаментальной науки для клинических исследователей , Elsevier, стр. 135–150, doi :10.1016/b978-0-12-803077-6.00008-4, ISBN 978-0-12-803077-6, получено 2024-02-14
  3. ^ Ladner RC (2007-01-01). «Картирование эпитопов антител». Biotechnology & Genetic Engineering Reviews . 24 (1): 1–30. CiteSeerX 10.1.1.536.6172 . doi :10.1080/02648725.2007.10648092. PMID  18059626. S2CID  34595289. 
  4. ^ ab Marks KM, Nolan GP (август 2006 г.). «Стратегии химической маркировки для биологии клетки». Nature Methods . 3 (8): 591–596. doi :10.1038/nmeth906. ISSN  1548-7091. PMID  16862131. S2CID  27848267.
  5. ^ Owenius R, Österlund M, Lindgren M, Svensson M, Olsen OH, Persson E, Freskgård PO, Carlsson U (октябрь 1999). «Свойства спиновых и флуоресцентных меток на интерфейсе рецептор-лиганд». Biophysical Journal . 77 (4): 2237–2250. Bibcode :1999BpJ....77.2237O. doi :10.1016/S0006-3495(99)77064-5. PMC 1300504 . PMID  10512843. 
  6. ^ Hökfelt T (ноябрь 1999). «Нейробиология благодаря микробиологии: наследие Альберта Х. Кунса (1912–1978)». Brain Research Bulletin . 50 (5–6): 371–372. doi :10.1016/S0361-9230(99)00109-4. PMID  10643440. S2CID  33618171.
  7. ^ Sheng W, Zhang C, Mohiuddin TM, Al-Rawe M, Zeppernick F, Falcone FH, Meinhold-Heerlein I, Hussain AF (2023-02-04). «Мультиплексная иммунофлуоресценция: мощный инструмент в иммунотерапии рака». International Journal of Molecular Sciences . 24 (4): 3086. doi : 10.3390/ijms24043086 . ISSN  1422-0067. PMC 9959383. PMID 36834500  . 
  8. ^ Franke WW, Schmid E, Osborn M, Weber K (октябрь 1978 г.). «Различные филаменты среднего размера, различаемые с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 75 (10): 5034–5038. Bibcode : 1978PNAS...75.5034F. doi : 10.1073 /pnas.75.10.5034 . PMC 336257. PMID  368806. 
  9. ^ Wang H, Lee EW, Cai X, Ni Z, Zhou L, Mao Q (декабрь 2008 г.). «Топология мембраны белка устойчивости к раку молочной железы человека (BCRP/ABCG2), определяемая вставкой эпитопа и иммунофлуоресценцией». Биохимия . 47 (52): 13778–13787. doi :10.1021/bi801644v. PMC 2649121. PMID  19063604 . 
  10. ^ Çelik S (январь 2015 г.). «Понимание сложности извлечения антигена из метилирования ДНК для измерения на основе иммунофлуоресценции и подход к решению проблемы». Журнал иммунологических методов . 416 : 1–16. doi : 10.1016/j.jim.2014.11.011. PMID  25435341.
  11. ^ Grimason A, Smith H, Parker J, Bukhari Z, Campbell A, Robertson L (март 1994 г.). «Применение DAPI и иммунофлуоресценции для улучшенной идентификации ооцист Cryptosporidium spp в образцах воды». Water Research . 28 (3): 733–736. Bibcode : 1994WatRe..28..733G. doi : 10.1016/0043-1354(94)90154-6.
  12. ^ abcde Пинья Р., Сантос-Диас А.И., Орта-Саласар Е., Агилар-Васкес А.Р., Мантельеро К.А., Акоста-Галеана I, Эстрада-Мондрагон А., Приор-Гонсалес М., Мартинес-Крус Дж.И., Росас-Арельяно А. (2022- 01-26). «Десять подходов, улучшающих иммуноокрашивание: обзор последних достижений в оптимизации иммунофлуоресценции». Международный журнал молекулярных наук . 23 (3): 1426. doi : 10.3390/ijms23031426 . ISSN  1422-0067. ПМЦ 8836139 . ПМИД  35163349. 
  13. ^ Al-Mughales JA (2022). «Паттерны антиядерных антител у пациентов с системной красной волчанкой и их корреляция с другими диагностическими иммунологическими параметрами». Front Immunol . 13 : 850759. doi : 10.3389/fimmu.2022.850759 . PMC 8964090. PMID  35359932 . 
    Незначительные изменения Микаэля Хэггстрёма, доктора медицинских наук
    . Лицензия Attribution 4.0 International (CC BY 4.0).
  14. ^ "Методы иммуногистохимического окрашивания" (PDF) . Руководство по иммуногистохимическому окрашиванию (шестое изд.). Dako Denmark A/S, компания Agilent Technologies. 2013. Архивировано из оригинала (PDF) 2016-08-03 . Получено 2014-05-14 .
  15. ^ Им К, Маренинов С, Диас МФ, Йонг WH (2019), Йонг WH (ред.), «Введение в выполнение иммунофлуоресцентного окрашивания», Biobanking , т. 1897, Нью-Йорк, Нью-Йорк: Springer New York, стр. 299–311, doi :10.1007/978-1-4939-8935-5_26, ISBN 978-1-4939-8933-1, PMC  6918834 , PMID  30539454
  16. ^ Yarilin D, Xu K, Turkekul M, Fan N, Romin Y, Fijisawa S, Barlas A, Manova-Todorova K (2015-03-31). "Машинный метод мультиплексной in situ молекулярной характеристики тканей с помощью иммунофлуоресцентного обнаружения". Scientific Reports . 5 (1): 9534. Bibcode :2015NatSR...5E9534Y. doi :10.1038/srep09534. ISSN  2045-2322. PMC 4821037 . PMID  25826597. 
  17. ^ "Фиксация и пермеабилизация в in[sic] иммуноцитохимии/иммунофлуоресценции (ICC/IF)". Novus Biologicals . 2024-02-14 . Получено 2024-02-14 .
  18. ^ Ehrhardt D (декабрь 2003 г.). «Технология GFP для визуализации живых клеток». Current Opinion in Plant Biology . 6 (6): 622–628. Bibcode : 2003COPB....6..622E. doi : 10.1016/j.pbi.2003.09.014. PMID  14611963.
  19. ^ Chalfie M (октябрь 1995). «Зеленый флуоресцентный белок». Фотохимия и фотобиология . 62 (4): 651–656. doi :10.1111/j.1751-1097.1995.tb08712.x. PMID  7480149. S2CID  3944607.
  20. ^ Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, Patel R, Macklin JJ, Normanno D, Singer RH, Lionnet T, Lavis LD (март 2015 г.). «Общий метод улучшения флуорофоров для микроскопии живых клеток и отдельных молекул». Nature Methods . 12 (3): 244–250. doi :10.1038/nmeth.3256. ISSN  1548-7091. PMC 4344395 . PMID  25599551. 
  21. ^ Хуан Б., Бейтс М., Чжуан Х. (2009-06-02). «Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения». Annual Review of Biochemistry . 78 : 993–1016. doi :10.1146/annurev.biochem.77.061906.092014. PMC 2835776. PMID  19489737 . 
  22. ^ Leung BO, Chou KC (2011-09-01). «Обзор флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения для биологии». Прикладная спектроскопия . 65 (9): 967–980. Bibcode : 2011ApSpe..65..967L. doi : 10.1366/11-06398. PMID  21929850. S2CID  5545465.

Внешние ссылки