stringtranslate.com

Генный нокдаун

Сокращение гена — это экспериментальная методика, с помощью которой снижается экспрессия одного или нескольких генов организма . Сокращение может происходить либо посредством генетической модификации , либо посредством обработки реагентом , таким как короткий олигонуклеотид ДНК или РНК , имеющий последовательность, комплементарную либо гену, либо транскрипту мРНК. [1]

Против кратковременного нокдауна

Если ДНК организма генетически модифицирована, полученный организм называется «нокдаун-организмом». Если изменение экспрессии гена вызвано связыванием олигонуклеотида с мРНК или временным связыванием с геном , это приводит к временному изменению экспрессии гена, которое не изменяет хромосомную ДНК, и результат называется «транзиентным нокдауном». [1]

При временном нокдауне связывание этого олигонуклеотида с активным геном или его транскриптами вызывает снижение экспрессии посредством различных процессов. Связывание может происходить либо через блокирование транскрипции (в случае связывания гена), деградацию транскрипта мРНК (например, с помощью малой интерферирующей РНК ( siRNA )) или антисмысловой последовательности, зависимой от РНКазы -H, либо через блокирование трансляции мРНК , сайтов сплайсинга пре-м РНК или сайтов расщепления нуклеазой , используемых для созревания других функциональных РНК, включая miRNA (например, с помощью морфолино- олиго или других антисмысловых последовательностей, независимых от РНКазы-H). [1] [2]

Наиболее прямое использование временных нокдаунов — изучение гена , который был секвенирован , но имеет неизвестную или не полностью известную функцию. Этот экспериментальный подход известен как обратная генетика . Исследователи делают выводы из того, как нокдаун отличается от особей, у которых интересующий ген функционирует. Временные нокдауны часто используются в биологии развития , поскольку олигонуклеотиды могут быть введены в одноклеточные зиготы и будут присутствовать в дочерних клетках введенной клетки в ходе эмбрионального развития. [3] Термин «нокдаун гена» впервые появился в литературе в 1994 году [4]

РНК-интерференция

РНК-интерференция (РНКi) — это способ подавления генов посредством деградации мРНК. [5] Подавление генов этим методом достигается путем введения в цитоплазму малых двухцепочечных интерферирующих РНК (siRNA). Малые интерферирующие РНК могут возникать внутри клетки или могут быть экзогенно введены в клетку. После введения в клетку экзогенные siRNA обрабатываются комплексом подавления, индуцированным РНК ( RISC ). [6] siRNA комплементарна целевой мРНК, которую необходимо подавить, и RISC использует siRNA в качестве шаблона для обнаружения целевой мРНК. После того, как RISC локализуется на целевой мРНК, РНК расщепляется рибонуклеазой.

РНК-интерференция широко используется в качестве лабораторного метода для генетического функционального анализа. [7] РНК-интерференция в таких организмах, как C. elegans и Drosophila melanogaster, обеспечивает быстрый и недорогой способ исследования функции генов. В исследовании C. elegans наличие таких инструментов, как библиотека РНК-интерференции Ahringer, дает лабораториям возможность тестировать множество генов в различных экспериментальных условиях. Информация, полученная в результате экспериментального использования РНК-интерференции, может быть полезна для определения потенциальных терапевтических целей, разработки лекарств или других приложений. [8] РНК-интерференция является очень полезным исследовательским инструментом, позволяющим исследователям проводить большие генетические скрининги в попытке определить цели для дальнейших исследований, связанных с определенным путем, лекарством или фенотипом. [9] [10]

CRISPR

Другой способ подавления экзогенной ДНК, обнаруженный у прокариот, — это механизм, включающий локусы, называемые «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами» или CRISPR . [11] Гены, ассоциированные с CRISPR (cas), кодируют клеточный аппарат, который разрезает экзогенную ДНК на небольшие фрагменты и вставляет их в локус повтора CRISPR. Когда эта область CRISPR ДНК экспрессируется клеткой, небольшие РНК, полученные из экзогенных вставок ДНК, служат последовательностью шаблона, которую другие белки Cas используют для подавления этой же экзогенной последовательности. Транскрипты коротких экзогенных последовательностей используются в качестве руководства для подавления этой чужеродной ДНК, когда она присутствует в клетке. Это служит своего рода приобретенным иммунитетом, и этот процесс похож на механизм прокариотической РНК-интерференции. Повторы CRISPR сохраняются среди многих видов и, как было показано, могут использоваться в клетках человека, [12] бактерий, [13] C. elegans , [14] данио-рерио , [15] и других организмах для эффективной манипуляции геномом. Использование CRISPR в качестве универсального исследовательского инструмента может быть проиллюстрировано [16] многими исследованиями, использующими его для создания организмов с изменениями генома.

TALENы

Другая технология, ставшая возможной благодаря манипуляции прокариотическим геномом, — это использование эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции ( TALEN ), для нацеливания на определенные гены. [17] TALEN — это нуклеазы, которые имеют два важных функциональных компонента: домен связывания ДНК и домен расщепления ДНК. Домен связывания ДНК представляет собой последовательность-специфическую эффекторную последовательность, подобную активаторам транскрипции, в то время как домен расщепления ДНК происходит от бактериальной эндонуклеазы и является неспецифическим. TALEN могут быть разработаны для расщепления последовательности, указанной последовательностью эффекторной части конструкции, подобной активаторам транскрипции. После разработки TALEN вводится в клетку в виде плазмиды или мРНК. TALEN экспрессируется, локализуется в своей целевой последовательности и расщепляет определенный сайт. После расщепления целевой последовательности ДНК TALEN клетка использует негомологичное соединение концов в качестве механизма репарации ДНК для исправления расщепления. Попытка клетки восстановить расщепленную последовательность может привести к тому, что закодированный белок станет нефункциональным, поскольку этот механизм восстановления приводит к ошибкам вставки или удаления в восстановленном месте.

Коммерциализация

До сих пор нокдаун-организмы с постоянными изменениями в ДНК создавались в основном в исследовательских целях. Также известные как просто нокдауны , эти организмы чаще всего используются для обратной генетики, особенно в таких видах, как мыши или крысы , для которых временные нокдаун-технологии не могут быть легко применены. [3] [18]

Существует несколько компаний, предлагающих коммерческие услуги, связанные с лечением методом отключения генов.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abc Summerton JE (2007). «Сравнение морфолино, siRNA и S-ДНК: влияние структуры и механизма действия на нецелевые эффекты и специфичность последовательности». Current Topics in Medicinal Chemistry . 7 (7): 651–60. doi :10.2174/156802607780487740. PMID  17430206. S2CID  12241724.
  2. ^ Summerton J (декабрь 1999 г.). «Морфолино-антисмысловые олигомеры: случай структурного типа, независимого от РНКазы H». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Структура и экспрессия генов . 1489 (1): 141–58. doi :10.1016/S0167-4781(99)00150-5. PMID  10807004.
  3. ^ ab Nasevicius A, Ekker SC (октябрь 2000 г.). «Эффективный целевой ген „нокдаун“ у данио-рерио». Nature Genetics . 26 (2): 216–20. doi :10.1038/79951. PMID  11017081. S2CID  21451111.
  4. ^ Валестедт, Клаес (февраль 1994 г.). «Стратегии антисмысловых олигонуклеотидов в нейрофармакологии». Trends Pharmacol Sci . 15 (2): 42–6. doi :10.1016/0165-6147(94)90107-4. PMID  8165722.
  5. ^ Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (февраль 1998 г.). «Мощное и специфическое генетическое вмешательство двухцепочечной РНК у Caenorhabditis elegans». Nature . 391 (6669): 806–11. Bibcode :1998Natur.391..806F. doi :10.1038/35888. PMID  9486653. S2CID  4355692.
  6. ^ Pratt AJ, MacRae IJ (июль 2009 г.). «Комплекс подавления экспрессии РНК: универсальная машина подавления экспрессии генов». Журнал биологической химии . 284 (27): 17897–901. doi : 10.1074/jbc.R900012200 . PMC 2709356. PMID  19342379 . 
  7. ^ Fraser AG, Kamath RS, Zipperlen P, Martinez-Campos M, Sohrmann M, Ahringer J (ноябрь 2000 г.). «Функциональный геномный анализ хромосомы I C. elegans с помощью систематической РНК-интерференции». Nature . 408 (6810): 325–30. Bibcode :2000Natur.408..325F. doi :10.1038/35042517. PMID  11099033. S2CID  4373444.
  8. ^ Aagaard L, Rossi JJ (март 2007 г.). «Терапия РНК-интерференцией: принципы, перспективы и проблемы». Advanced Drug Delivery Reviews . 59 (2–3): 75–86. doi :10.1016/j.addr.2007.03.005. PMC 1978219. PMID 17449137  . 
  9. ^ Kamath RS, Ahringer J (август 2003 г.). «Полногеномный скрининг РНКi у Caenorhabditis elegans». Методы . 30 (4): 313–21. doi :10.1016/S1046-2023(03)00050-1. PMID  12828945.
  10. ^ Ghadakzadeh S, Mekhail M, Aoude A, Hamdy R, Tabrizian M (март 2016 г.). «Маленькие игроки, правящие в жесткой игре: siRNA в регенерации костей». Журнал исследований костей и минералов . 31 (3): 475–87. doi : 10.1002/jbmr.2816 . PMID  26890411.
  11. ^ Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (июль 2013 г.). "CRISPR-опосредованная модульная РНК-управляемая регуляция транскрипции у эукариот". Cell . 154 (2): 442–51. doi :10.1016/j.cell.2013.06.044. PMC 3770145 . PMID  23849981. 
  12. ^ Esvelt KM, Mali P, Braff JL, Moosburner M, Yaung SJ, Church GM (ноябрь 2013 г.). «Ортогональные белки Cas9 для РНК-управляемой регуляции генов и редактирования» (PDF) . Nature Methods . 10 (11): 1116–21. doi :10.1038/nmeth.2681. PMC 3844869. PMID  24076762 . 
  13. ^ Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA (март 2013 г.). «РНК-управляемое редактирование бактериальных геномов с использованием систем CRISPR-Cas». Nature Biotechnology . 31 (3): 233–9. doi :10.1038/nbt.2508. PMC 3748948 . PMID  23360965. 
  14. ^ Chen C, Fenk LA, de Bono M (ноябрь 2013 г.). «Эффективное редактирование генома у Caenorhabditis elegans с помощью гомологичной рекомбинации с использованием CRISPR». Nucleic Acids Research . 41 (20): e193. doi :10.1093/nar/gkt805. PMC 3814388. PMID  24013562 . 
  15. ^ Hisano Y, Ota S, Kawahara A (январь 2014 г.). «Редактирование генома с использованием искусственных сайт-специфических нуклеаз у данио-рерио». Развитие, рост и дифференциация . 56 (1): 26–33. doi : 10.1111/dgd.12094 . PMID  24117409.
  16. ^ Gennequin B, Otte DM, Zimmer A (ноябрь 2013 г.). «CRISPR/Cas-индуцированные двухцепочечные разрывы повышают частоту замен генов для гуманизации гена Cnr2 мыши». Biochemical and Biophysical Research Communications . 441 (4): 815–9. doi :10.1016/j.bbrc.2013.10.138. PMID  24211574.
  17. ^ Sun N, Zhao H (июль 2013 г.). «Эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN): высокоэффективный и универсальный инструмент для редактирования генома». Биотехнология и биоинженерия . 110 (7): 1811–21. doi :10.1002/bit.24890. PMID  23508559. S2CID  6214542.
  18. ^ "Adenoviral Gene Knockdown Cells". Sirion Biotech. Архивировано из оригинала 9 июля 2013 года . Получено 17 апреля 2013 года .

Внешние ссылки