Нокаутная крыса — это генетически модифицированная крыса с одним геном , выключенным посредством целенаправленной мутации ( перехват генов ), используемая для академических и фармацевтических исследований . Нокаутные крысы могут имитировать человеческие заболевания и являются важными инструментами для изучения функции генов ( функциональная геномика ), а также для открытия и разработки лекарств . Производство нокаутных крыс не было экономически или технически осуществимо до 2008 года. [1] [2] [3] [4]
Технология, разработанная благодаря финансированию Национальных институтов здравоохранения (NIH) и работе, проделанной членамиKnock Out Rat Consortium (KORC) привел к экономически эффективным методам создания крыс с нокаутом. Важность разработки крысы как более универсального инструмента для исследований в области здоровья человека подтверждается инвестициями в размере 120 миллионов долларов, сделанными NIH черезКонсорциум проекта по секвенированию генома крысы , в результате чего был получен черновой вариант последовательности лабораторного штамма серой или норвежской крысы ( Rattus norvegicus ). [5] Дополнительные разработки с технологией цинк-пальцевой нуклеазы в 2009 году привели к первой крысе с нокаутом с целевыми мутациями, передаваемыми по зародышевой линии. [6] Модели заболеваний крыс с нокаутом для болезни Паркинсона , болезни Альцгеймера , гипертонии и диабета с использованием технологии цинк-пальцевой нуклеазы в настоящее время коммерциализируются SAGE Labs. [7] [8]
Мыши, крысы и люди разделяют все, кроме приблизительно 1% генов друг друга [5] [9] [10], что делает грызунов хорошими модельными организмами для изучения функции человеческих генов. И мыши, и крысы относительно малы, просты в обращении, имеют короткое время генерации и генетически инбридинг. Хотя мыши оказались полезной моделью грызунов, и были разработаны методы для рутинного нарушения их генов, во многих случаях крысы считаются превосходным лабораторным животным для изучения и моделирования человеческих заболеваний.
Крысы физиологически более похожи на людей, чем мыши. Например, у крыс частота сердечных сокращений больше похожа на человеческую, в то время как у мышей частота сердечных сокращений в пять-десять раз выше. Широко распространено мнение, что крыса является лучшей моделью, чем мышь, для сердечно-сосудистых заболеваний человека , диабета, артрита и многих аутоиммунных , неврологических , поведенческих и наркотических расстройств. [11] Кроме того, модели крыс превосходят модели мышей для тестирования фармакодинамики и токсичности потенциальных терапевтических соединений, отчасти потому, что количество и тип многих из их детоксицирующих ферментов очень похожи на таковые у людей. [12] Их больший размер делает крыс более подходящими для изучения с помощью инструментов, а также облегчает манипуляции, такие как забор крови, нервная проводимость и проведение хирургических операций.
Методы генетической манипуляции доступны на мышах, которые обычно используются для моделирования человеческих заболеваний. Хотя опубликованные нокауты существуют примерно для 60% [13] генов мышей, для большинства распространенных человеческих заболеваний нет нокаутной мышиной модели. Нокаутные крысиные модели являются альтернативой мышам, которая может позволить создавать новые нарушения генов, недоступные у мышей. Нокаутные крысиные модели также могут дополнять существующие трансгенные мышиные модели. Сравнение мутантов мышей и крыс может облегчить различие между специфичными для грызунов и общими фенотипами млекопитающих .
Модели крыс использовались для продвижения многих областей медицинских исследований, включая сердечно-сосудистые заболевания, психиатрические расстройства (исследования поведенческого вмешательства и зависимости), регенерацию нейронов , диабет, трансплантацию , аутоиммунные расстройства ( ревматоидный артрит ), рак , а также заживление ран и костей. Хотя завершение последовательности генома крысы дает очень важную информацию, то, как эти заболевания связаны с функцией гена, требует эффективного метода создания моделей крыс с нокаутом, в которых манипулируются определенными геномными последовательностями. Большинство методов генетической манипуляции, включая случайный мутагенез с генной ловушкой (на основе ретровирусов и не на основе ретровирусов), нокауты/нок-ины генов и условные мутации, зависят от культуры и манипуляции эмбриональными стволовыми (ЭС) клетками. [14] ЭС клетки крысы были выделены лишь недавно, и не было зарегистрировано никаких демонстраций генной модификации в них. Следовательно, многие методы генетической манипуляции, широко используемые у мышей, невозможны у крыс.
До коммерческой разработки технологии мобильной ДНК в 2007 году и технологии цинковых пальцев нуклеазы в 2009 году существовало только две технологии, которые можно было использовать для создания моделей человеческих заболеваний на крысах: клонирование и химический мутагенез с использованием N-этил-N-нитрозомочевины ( ENU ). Хотя клонирование с помощью переноса ядра соматической клетки (SCNT) теоретически можно было бы использовать для создания крыс со специфическими мутациями путем мутации соматических клеток, а затем использования этих клеток для SCNT, этот подход не был успешно использован для создания крыс с нокаутом. Одна из проблем этой стратегии заключается в том, что SCNT крайне неэффективна. Первая опубликованная попытка имела показатель успешности менее 1%. [15] В качестве альтернативы, мутагенез ENU является распространенной стратегией случайного мутагенеза с нокаутом генов у мышей, которую также можно использовать у крыс. Мутагенез ENU включает использование химического вещества N-этил-N-нитрозомочевины (ENU) для создания изменений одного основания в геноме. ENU переносит свою этильную группу на радикалы кислорода или азота в ДНК, что приводит к неправильному спариванию и замене пар оснований. Мутантных животных можно получить, введя самцу мыши ENU и скрестив его с самкой дикого типа, чтобы получить мутантное потомство. Мутагенез ENU создает высокую частоту случайных мутаций, примерно с одним изменением пары оснований в любом данном гене на каждые 200-700 гамет. [16] Несмотря на его высокую мутагенность, физическое проникновение ENU ограничено, и только около 500 генов мутируют для каждого самца, и очень небольшое количество от общего числа мутаций имеют наблюдаемый фенотип. Обычно необходимо создать тысячи мутаций у одного животного, чтобы создать один новый фенотип.
Несмотря на недавние усовершенствования в технологии ENU, [17] [18] [19] картирование мутаций, ответственных за определенный фенотип, обычно является сложным и требует много времени. Нейтральные мутации должны быть отделены от причинных мутаций путем обширного разведения. Методы ENU и клонирования просто неэффективны для создания и картирования нокаутов генов у крыс для создания новых моделей человеческих заболеваний. До 2007 года крупнейший на сегодняшний день проект по мутагенезу крыс ENU, реализуемый Медицинским колледжем Висконсина, смог произвести только 9 нокаутных линий крыс за пятилетний период при средней стоимости 200 000 долларов за нокаутированную линию. Хотя некоторые компании все еще придерживаются этой стратегии, Медицинский колледж Висконсина перешел на более эффективный и коммерчески жизнеспособный метод с использованием мобильной ДНК и технологии CompoZr ZFN.
Нуклеазы цинковых пальцев (ZFN) и эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), представляют собой сконструированные ДНК-связывающие белки, которые облегчают целенаправленное редактирование генома путем создания двухцепочечных разрывов в ДНК в указанных пользователем местах. Двухцепочечные разрывы важны для сайт-специфического мутагенеза, поскольку они стимулируют естественные процессы репарации ДНК клетки, а именно гомологичную рекомбинацию и негомологичное соединение концов. Когда клетка использует путь негомологичного соединения концов для восстановления двухцепочечного разрыва, присущая неточность восстановления часто генерирует точно направленные мутации. Это приводит к эмбрионам с целевым нокаутом гена. [6] [20] Стандартные методы микроинъекции позволяют этой технологии создавать нокаутированных крыс за 4–6 месяцев. Главным преимуществом нокаута генов с помощью ZFN и TALEN по сравнению с использованием мобильной ДНК является то, что конкретный ген может быть уникально и специфично нацелен на нокаут. Напротив, нокауты, сделанные с использованием технологии мобильной ДНК, являются случайными и, следовательно, вряд ли будут нацелены на интересующий ген.
Технология мобильной ДНК (прыгающий ген) использует ретротранспозоны и транспозоны для производства моделей крыс с нокаутом. Эта технологическая платформа соответствует всем критериям успешного подхода к нокауту генов у млекопитающих, позволяя проводить случайный мутагенез непосредственно в зародышевых клетках ( сперма и ооциты ) модельных организмов млекопитающих, включая крыс. Используя эту технологию, гены полностью и стабильно разрушаются, нокаутируются с высокой частотой и случайным образом нарушаются по всему геному. Геномное расположение мутаций можно легко картировать, создавая библиотеку нокаутированных крыс для последующего использования. После создания случайных нокаутированных мутаций можно создавать более совершенные мутации, такие как условные мутации, путем скрещивания нокаутированных линий с линиями крыс, экспрессирующими рекомбиназу CRE специфичным для ткани образом. Нокаины можно получать путем обмена кассетами, опосредованного рекомбинацией.
piggyBac (PB) ДНК-транспозоны мобилизуются посредством механизма «вырезать и вставить», посредством которого фермент транспозаза (PB-транспозаза), кодируемый самим транспозоном, вырезает и повторно интегрирует транспозон в других местах генома. PB-транспозаза специфически распознает инвертированные концевые повторы PB (ITR), которые фланкируют транспозон; она связывается с этими последовательностями и катализирует вырезание транспозона. Затем PB интегрируется в сайты TTAA [21] по всему геному относительно случайным образом. Для создания мутаций генной ловушки (или адаптирована для получения трансгенных животных) транспозаза поставляется в транс-положении на одной плазмиде и ко-трансфицируется с плазмидой, содержащей донорский транспозон, рекомбинантный транспозон, содержащий генную ловушку, фланкированную сайтами связывания для транспозазы (ITR). Транспозаза катализирует вырезание транспозона из плазмиды и последующую интеграцию в геном. Интеграция в кодирующую область захватит элементы, необходимые для экспрессии генной ловушки. PB обладает несколькими идеальными свойствами: (1) он предпочтительно встраивается в гены (от 50 до 67% вставок попадают в гены) (2) он не проявляет локальных перескоков (широко распространенное геномное покрытие) (3) он не чувствителен к ингибированию сверхпродукции, при котором повышенные уровни транспозазы вызывают снижение транспозиции 4) он чисто вырезает из донорского участка, не оставляя «следа», в отличие от Спящей красавицы. [22] [23]
Транспозон спящей красавицы (SB) является производным от суперсемейства ДНК-транспозонов Tc1/mariner, распространенного в геномах как позвоночных, так и беспозвоночных. Однако эндогенные ДНК-транспозоны из этого семейства полностью неактивны в геномах позвоночных. Активный транспозон Tc1/mariner, синтезированный путем выравнивания неактивных транспозонов из подсемейства элементов лососевых, был «разбужен» для формирования транспозона, названного Спящей красавицей. [24] SB, как и другие ДНК-транспозоны, мобилизует себя с помощью механизма вырезания и вставки, посредством которого фермент транспозаза, кодируемый самим транспозоном, вырезает и повторно интегрирует транспозон в других местах генома. Белок SB из 340 аминокислот распознает инвертированные концевые повторы (ITR), которые фланкируют транспозон; он связывается с этими последовательностями и катализирует вырезание транспозона. Затем SB интегрируется в случайные сайты в геноме, хотя некоторые исследования сообщают об очень небольших предпочтениях в отношении транскрипционных единиц. [25] [26] Также существует простое требование к TA-динуклеотиду в целевом сайте, как и для всех транспозонов Tc1/mariner. [27]
Транспозон SB является мощным инструментом для инсерционного мутагенеза у многих видов позвоночных. Недавно он продемонстрировал особую полезность для мутагенеза зародышевой линии у мышей и крыс. [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] Существует несколько преимуществ, которые делают SB весьма привлекательным мутагеном, ориентированным на открытие генов: 1) он имеет небольшую предвзятость для вставки в определенные геномные регионы или в определенные последовательности распознавания, 2) вставки транспозона de novo обеспечивают «помеченный» маркер последовательности для быстрой идентификации определенной мутации с помощью простых методов клонирования ПЦР, 3) in vivo инсерционный мутагенез SB позволяет быстро и легко генерировать несколько мутаций у одного животного и в одной ткани, такой как аденоматозный полип.
Транспозоны и ретротранспозоны являются ценными инструментами для беспристрастного открытия генов в качестве мобильных фрагментов ДНК, используемых для нарушения генов. Ретротранспозоны, такие как LINE (длинные перемежающиеся ядерные элементы), мобилизуются с помощью механизма «копирования и вставки» и широко распространены во многих эукариотических видах. Несколько ретротранспозонов L1 остались активными у мышей и людей. L1 содержат небольшой внутренний промотор в 5'-нетранслируемой области для управления экспрессией, две открытые рамки считывания (ORF) и 3'-нетранслируемую область, содержащую последовательности для полиаденилирования. Две ORF кодируют белки, необходимые для автономной ретротранспозиции; ORF1 кодирует белок, связывающий РНК , в то время как ORF2 кодирует белок, содержащий эндонуклеазную (EN) и обратную транскриптазную (RT) активность, которые надрезают участок в ДНК, а затем производят копию с помощью RT. Эти белки проявляют подавляющую специфичность для связывания и воздействия на транскрипт, который их кодирует, что позволяет практически исключительно мобилизовать родительскую РНК L1. Используя активность ОТ белка ORF2, транскрибированная РНК L1 копируется в ДНК с помощью процесса, называемого целевой праймированной обратной транскрипцией (TPRT), [35] и интегрируется в геном. Интеграция происходит с небольшим смещением для любой конкретной области генома, требуя простой консенсусной последовательности, 5'TTTT'A-3' (вместе с небольшими вариациями этой последовательности). Интегрированные последовательности L1 часто усекаются на 5' конце, со средним общим размером 1 Кб, многие содержат только 3' концевые последовательности.
Природа ретротранспозиции наделяет L1 некоторыми уникальными преимуществами; ретротранспозоны L1 имеют по существу неограниченный запас инсерционного мутагена, поскольку он непрерывно транскрибируется с промотора, что было бы полезно для приложений, где требуется большое количество мутаций в одной клетке. Элементы L1 также демонстрируют широкое геномное покрытие с в значительной степени случайным распределением инсерций. [36] [37] [38] Инсерции L1 в геномных сайтах также необратимы, и, таким образом, любое мутагенное событие, вызванное инсерцией L1, «помечается» последовательностями L1.