Нуклеосома — это основная структурная единица упаковки ДНК у эукариот . Структура нуклеосомы состоит из сегмента ДНК, намотанного вокруг восьми гистоновых белков [1] , и напоминает нить, намотанную на катушку. Нуклеосома — это фундаментальная субъединица хроматина . Каждая нуклеосома состоит из чуть менее двух витков ДНК, намотанной вокруг набора из восьми белков, называемых гистонами, которые известны как гистоновый октамер . Каждый гистоновый октамер состоит из двух копий каждого из гистоновых белков H2A , H2B , H3 и H4 .
ДНК должна быть уплотнена в нуклеосомы, чтобы поместиться в ядре клетки . [2] В дополнение к обертыванию нуклеосом, эукариотический хроматин еще больше уплотняется, складываясь в ряд более сложных структур, в конечном итоге образуя хромосому . Каждая клетка человека содержит около 30 миллионов нуклеосом. [3]
Предполагается, что нуклеосомы несут эпигенетически унаследованную информацию в форме ковалентных модификаций их основных гистонов . Положения нуклеосом в геноме не случайны, и важно знать, где расположена каждая нуклеосома, поскольку это определяет доступность ДНК для регуляторных белков . [4]
Нуклеосомы впервые наблюдались как частицы в электронном микроскопе Доном и Адой Олинс в 1974 году [5] , а их существование и структура (как октамеры гистонов, окруженные примерно 200 парами оснований ДНК) были предложены Роджером Корнбергом . [6] [7] Роль нуклеосомы как регулятора транскрипции была продемонстрирована Лорхом и др. in vitro [8] в 1987 году, а также Ханом и Грунштейном [9] и Кларк-Адамсом и др. [10] in vivo в 1988 году.
Частица ядра нуклеосомы состоит приблизительно из 146 пар оснований (пн) ДНК [11], обернутых в 1,67 левозакрученных суперспиральных витков вокруг гистонового октамера, состоящего из 2 копий каждого из основных гистонов H2A , H2B , H3 и H4 . [12] Частицы ядра соединены участками линкерной ДНК , длина которых может достигать 80 пн. Технически нуклеосома определяется как основная частица плюс одна из этих линкерных областей; однако это слово часто является синонимом основной частицы. [13] Карты позиционирования нуклеосом по всему геному теперь доступны для многих модельных организмов и клеток человека. [14]
Линкерные гистоны, такие как H1 и его изоформы, участвуют в уплотнении хроматина и располагаются у основания нуклеосомы около входа и выхода ДНК, связываясь с линкерной областью ДНК. [15] Неконденсированные нуклеосомы без линкерного гистона напоминают «бусины на нити ДНК» под электронным микроскопом . [16]
В отличие от большинства эукариотических клеток, зрелые сперматозоиды в основном используют протамины для упаковки своей геномной ДНК, скорее всего, для достижения еще более высокого коэффициента упаковки. [17] Гистоновые эквиваленты и упрощенная структура хроматина также были обнаружены у архей , [18] что позволяет предположить, что эукариоты — не единственные организмы, которые используют нуклеосомы.
Пионерские структурные исследования в 1980-х годах группой Аарона Клуга предоставили первые доказательства того, что октамер гистоновых белков оборачивает ДНК вокруг себя примерно в 1,7 оборота левой суперспирали. [19] В 1997 году группа из Ричмонда решила первую кристаллическую структуру нуклеосомы с почти атомным разрешением, показав наиболее важные детали частицы. Человеческая альфа-сателлитная палиндромная ДНК, имеющая решающее значение для достижения кристаллической структуры нуклеосомы 1997 года, была разработана группой Буника в Национальной лаборатории Оук-Ридж в Теннесси. [20] [21] [22] [23] [24] На сегодняшний день решены структуры более 20 различных частиц ядра нуклеосомы, [25] включая те, которые содержат варианты гистонов и гистоны из разных видов. Структура ядра нуклеосомы удивительно консервативна, и даже изменение более 100 остатков между гистонами лягушки и дрожжей приводит к картам электронной плотности с общим среднеквадратичным отклонением всего 1,6Å. [26]
Частица ядра нуклеосомы (показана на рисунке) состоит из примерно 146 пар оснований ДНК [11], обернутых в 1,67 левозакрученных суперспиральных витков вокруг гистонового октамера , состоящего из 2 копий каждого из ядерных гистонов H2A , H2B , H3 и H4 . Соседние нуклеосомы соединены участком свободной ДНК, называемым линкерной ДНК (длина которой варьируется от 10 до 80 п.н. в зависимости от вида и типа ткани [18] ). Вся структура образует цилиндр диаметром 11 нм и высотой 5,5 нм.
Частицы ядра нуклеосомы наблюдаются, когда хроматин в интерфазе обрабатывается, чтобы заставить хроматин частично развернуться. Полученное изображение, полученное с помощью электронного микроскопа, представляет собой «бусины на нитке». Нить — это ДНК, в то время как каждая бусина в нуклеосоме — это частица ядра. Частица ядра нуклеосомы состоит из ДНК и гистоновых белков. [29]
Частичное переваривание ДНКазой хроматина выявляет его нуклеосомную структуру. Поскольку участки ДНК частиц ядра нуклеосомы менее доступны для ДНКазы, чем связующие участки, ДНК переваривается на фрагменты длиной, равной кратности расстояния между нуклеосомами (180, 360, 540 пар оснований и т. д.). Поэтому во время гель-электрофореза этой ДНК виден очень характерный рисунок, похожий на лестницу . [27] Такое переваривание может происходить также в естественных условиях во время апоптоза («самоубийство клетки» или запрограммированная смерть клетки), поскольку его роль обычно заключается в саморазрушении ДНК . [30]
Основные гистоновые белки содержат характерный структурный мотив, называемый «гистоновой складкой», который состоит из трех альфа-спиралей (α1-3), разделенных двумя петлями (L1-2). В растворе гистоны образуют гетеродимеры H2A-H2B и гетеротетрамеры H3-H4. Гистоны димеризуются вокруг своих длинных спиралей α2 в антипараллельной ориентации, и, в случае H3 и H4, два таких димера образуют 4-спиральный пучок, стабилизированный обширным взаимодействием H3-H3'. Димер H2A/H2B связывается с тетрамером H3/H4 из-за взаимодействий между H4 и H2B, которые включают образование гидрофобного кластера. [12] Октамер гистона образован центральным тетрамером H3/H4, зажатым между двумя димерами H2A/H2B. Из-за сильного основного заряда всех четырех основных гистонов октамер гистонов стабилен только в присутствии ДНК или очень высоких концентраций соли.
Нуклеосома содержит более 120 прямых взаимодействий белок-ДНК и несколько сотен взаимодействий, опосредованных водой. [31] Прямые взаимодействия белок-ДНК не распределены равномерно по поверхности октамера, а расположены в отдельных участках. Это обусловлено образованием двух типов участков связывания ДНК внутри октамера; участка α1α1, который использует спираль α1 из двух соседних гистонов, и участка L1L2, образованного петлями L1 и L2. Солевые связи и водородные связи как между основными и гидроксильными группами боковой цепи, так и между амидами основной цепи с фосфатами остова ДНК образуют основную часть взаимодействий с ДНК. Это важно, учитывая, что повсеместное распределение нуклеосом вдоль геномов требует, чтобы он был неспецифичным для последовательности фактором связывания ДНК. Хотя нуклеосомы, как правило, предпочитают некоторые последовательности ДНК другим, [32] они способны связываться практически с любой последовательностью, что, как полагают, обусловлено гибкостью в формировании этих взаимодействий, опосредованных водой. Кроме того, неполярные взаимодействия осуществляются между боковыми цепями белка и группами дезоксирибозы, а боковая цепь аргинина интеркалирует в малую бороздку ДНК во всех 14 местах, где она обращена к поверхности октамера. Распределение и прочность участков связывания ДНК вокруг поверхности октамера искажают ДНК внутри ядра нуклеосомы. ДНК неравномерно изогнута и также содержит дефекты скручивания. Скручивание свободной B-формы ДНК в растворе составляет 10,5 п.н. на виток. Однако общее скручивание нуклеосомной ДНК составляет всего 10,2 п.н. на виток, варьируясь от значения 9,4 до 10,9 п.н. на виток.
Гистоновые хвостовые отростки составляют до 30% массы гистонов, но не видны в кристаллических структурах нуклеосом из-за их высокой внутренней гибкости и считаются в значительной степени неструктурированными. [33] N-концевые хвосты гистонов H3 и H2B проходят через канал, образованный малыми бороздками двух цепей ДНК, выступая из ДНК каждые 20 п.н. N-концевой хвост гистона H4, с другой стороны, имеет область высокоосновных аминокислот (16–25), которая в кристаллической структуре образует взаимодействие с высококислотной поверхностной областью димера H2A-H2B другой нуклеосомы, будучи потенциально релевантной для структуры нуклеосом более высокого порядка. Считается, что это взаимодействие происходит также в физиологических условиях и предполагает, что ацетилирование хвоста H4 искажает структуру хроматина более высокого порядка. [ необходима цитата ]
Организация ДНК, которая достигается нуклеосомой, не может полностью объяснить упаковку ДНК, наблюдаемую в ядре клетки. Дальнейшее уплотнение хроматина в ядре клетки необходимо, но оно еще не до конца изучено. Текущее понимание [25] заключается в том, что повторяющиеся нуклеосомы с промежуточной «линкерной» ДНК образуют 10-нм волокно , описываемое как «бусины на нитке», и имеют коэффициент упаковки примерно пять к десяти. [18] Цепочка нуклеосом может быть организована в 30-нм волокно , компактную структуру с коэффициентом упаковки ~50 [18] , и формирование которой зависит от присутствия гистона H1 .
Кристаллическая структура тетрануклеосомы была представлена и использована для построения предлагаемой структуры 30-нм волокна в виде двухзаходной спирали. [34] Все еще существует определенное количество разногласий относительно этой модели, поскольку она несовместима с последними данными электронной микроскопии . [35] Помимо этого, структура хроматина плохо изучена, но классически предполагается, что 30-нм волокно организовано в петли вдоль центрального белкового каркаса, образуя транскрипционно активный эухроматин . Дальнейшее уплотнение приводит к транскрипционно неактивному гетерохроматину .
Хотя нуклеосома является очень стабильным комплексом белок-ДНК, она не статична и, как было показано, претерпевает ряд различных структурных перестроек, включая скольжение нуклеосомы и экспозицию участка ДНК. В зависимости от контекста нуклеосомы могут ингибировать или облегчать связывание факторов транскрипции. Положения нуклеосом контролируются тремя основными вкладами: во-первых, внутренняя аффинность связывания гистонового октамера зависит от последовательности ДНК. Во-вторых, нуклеосома может быть смещена или рекрутирована конкурентным или кооперативным связыванием других белковых факторов. В-третьих, нуклеосома может активно транслоцироваться АТФ-зависимыми ремоделирующими комплексами. [36]
Работа, выполненная в лаборатории Брэдбери, показала, что нуклеосомы, восстановленные на позиционирующей последовательности ДНК 5S, были способны трансляционно перепозиционироваться на соседние последовательности при термической инкубации. [37] Более поздние работы показали, что это перепозиционирование не требовало разрушения гистонового октамера, но согласовывалось с тем, что нуклеосомы могли «скользить» по ДНК в цис-положении . В 2008 году было дополнительно обнаружено, что сайты связывания CTCF действуют как якоря позиционирования нуклеосом, так что при использовании для выравнивания различных геномных сигналов можно легко идентифицировать несколько фланкирующих нуклеосом. [38] Хотя нуклеосомы по своей природе мобильны, эукариоты развили большое семейство АТФ-зависимых ферментов ремоделирования хроматина для изменения структуры хроматина, многие из которых делают это посредством скольжения нуклеосом. В 2012 году лаборатория Бины Пиллаи продемонстрировала, что скольжение нуклеосом является одним из возможных механизмов крупномасштабной тканеспецифической экспрессии генов. Работа показывает, что сайт начала транскрипции для генов, экспрессируемых в определенной ткани, является нуклеосомно-истощенным, в то время как тот же набор генов в другой ткани, где они не экспрессируются, является нуклеосомно-связанным. [39]
Работа лаборатории Видома показала, что нуклеосомная ДНК находится в равновесии между завернутым и развернутым состоянием. Измерения этих скоростей с использованием FRET с временным разрешением показали, что ДНК внутри нуклеосомы остается полностью завернутой всего 250 мс, прежде чем она разворачивается в течение 10-50 мс, а затем быстро заворачивается снова. [40] Это означает, что ДНК не нужно активно диссоциировать от нуклеосомы, но что есть значительная часть времени, в течение которого она полностью доступна. Действительно, это можно распространить на наблюдение, что введение ДНК-связывающей последовательности внутри нуклеосомы увеличивает доступность соседних областей ДНК при связывании. [41] Эта склонность ДНК внутри нуклеосомы к «дыханию» имеет важные функциональные последствия для всех ДНК-связывающих белков, которые действуют в среде хроматина. [40] В частности, динамическое дыхание нуклеосом играет важную роль в ограничении продвижения РНК-полимеразы II во время элонгации транскрипции. [42]
Промоторы активных генов имеют области, свободные от нуклеосом (NFR). Это обеспечивает доступность ДНК промотора для различных белков, таких как факторы транскрипции. Область, свободная от нуклеосом, обычно охватывает 200 нуклеотидов в S. cerevisiae [43] Хорошо расположенные нуклеосомы образуют границы NFR. Эти нуклеосомы называются +1-нуклеосомой и −1-нуклеосомой и расположены на канонических расстояниях ниже и выше по течению, соответственно, от места начала транскрипции. [44] +1-нуклеосома и несколько нуклеосом ниже по течению также имеют тенденцию включать вариант гистона H2A.Z. [44]
Геномы эукариот повсеместно связаны с хроматином; однако клетки должны пространственно и временно регулировать определенные локусы независимо от основного хроматина. Для достижения высокого уровня контроля, необходимого для координации ядерных процессов, таких как репликация, репарация и транскрипция ДНК, клетки разработали множество средств для локальной и специфической модуляции структуры и функции хроматина. Это может включать ковалентную модификацию гистонов, включение вариантов гистонов и нековалентное ремоделирование с помощью АТФ-зависимых ремоделирующих ферментов.
С момента их открытия в середине 1960-х годов было предсказано, что модификации гистонов влияют на транскрипцию. [45] Тот факт, что большинство ранних посттрансляционных модификаций были сосредоточены в хвостовых расширениях, которые выступают из ядра нуклеосомы, приводит к двум основным теориям относительно механизма модификации гистонов. Первая из теорий предполагала, что они могут влиять на электростатические взаимодействия между хвостами гистонов и ДНК, чтобы «ослабить» структуру хроматина. Позже было предложено, что комбинации этих модификаций могут создавать связывающие эпитопы, с которыми можно рекрутировать другие белки. [46] Недавно, учитывая, что в структурированных областях гистонов было обнаружено больше модификаций, было выдвинуто предположение, что эти модификации могут влиять на взаимодействия гистон-ДНК [47] и гистон-гистон [48] в ядре нуклеосомы. Модификации (такие как ацетилирование или фосфорилирование), которые снижают заряд глобулярного гистонового ядра, как предсказывают, «ослабляют» связь ядра с ДНК; сила эффекта зависит от местоположения модификации в ядре. [49] Было показано, что некоторые модификации коррелируют с подавлением генов; другие, по-видимому, коррелируют с активацией генов. Распространенные модификации включают ацетилирование , метилирование или убиквитинирование лизина ; метилирование аргинина ; и фосфорилирование серина . Информация, сохраненная таким образом, считается эпигенетической , поскольку она не кодируется в ДНК , но все еще наследуется дочерними клетками. Поддержание репрессированного или активированного статуса гена часто необходимо для клеточной дифференциации . [18]
Хотя гистоны в значительной степени сохранялись на протяжении всей эволюции, было выявлено несколько вариантных форм. Эта диверсификация функций гистонов ограничивается H2A и H3, при этом H2B и H4 в основном инвариантны. H2A может быть заменен на H2AZ (что приводит к снижению стабильности нуклеосом) или H2AX (что связано с репарацией ДНК и дифференциацией Т-клеток ), тогда как неактивные X-хромосомы у млекопитающих обогащены макроH2A. H3 может быть заменен на H3.3 (что коррелирует с активацией генов и регуляторными элементами), а в центромерах H3 заменяется на CENPA . [18]
Ряд различных реакций связан с термином АТФ-зависимое ремоделирование хроматина . Было показано, что ферменты ремоделирования скользят по нуклеосомам вдоль ДНК, [50] нарушают контакты гистон-ДНК до такой степени, что дестабилизируют димер H2A/H2B [51] [52] и создают отрицательное суперспиральное скручивание в ДНК и хроматине. [53] Недавно было показано, что фермент ремоделирования Swr1 вводит вариант гистона H2A.Z в нуклеосомы. [54] В настоящее время неясно, представляют ли все они различные реакции или просто альтернативные результаты общего механизма. Что общего между всеми ними, и действительно отличительной чертой АТФ-зависимого ремоделирования хроматина, так это то, что все они приводят к изменению доступности ДНК.
Исследования, изучающие активацию генов in vivo [55] и, что еще более удивительно, ремоделирование in vitro [56], показали, что события ремоделирования хроматина и связывание факторов транскрипции имеют циклический и периодический характер. Хотя последствия этого для механизма реакции ремоделирования хроматина неизвестны, динамическая природа системы может позволить ей быстрее реагировать на внешние стимулы. Недавнее исследование показывает, что положения нуклеосом значительно изменяются во время развития эмбриональных стволовых клеток мыши, и эти изменения связаны со связыванием факторов транскрипции развития. [57]
Исследования 2007 года каталогизировали положения нуклеосом в дрожжах и показали, что нуклеосомы истощены в промоторных областях и точках начала репликации . [58] [59] [60] Около 80% генома дрожжей, по-видимому, покрыто нуклеосомами [61] , и характер позиционирования нуклеосом явно связан с областями ДНК, которые регулируют транскрипцию , областями, которые транскрибируются, и областями, которые инициируют репликацию ДНК. [62] Совсем недавно новое исследование изучало динамические изменения в перемещении нуклеосом во время глобального события транскрипционного перепрограммирования, чтобы выяснить влияние на смещение нуклеосом во время общегеномных транскрипционных изменений у дрожжей ( Saccharomyces cerevisiae ). [63] Результаты показали, что нуклеосомы, которые были локализованы в промоторных областях, смещаются в ответ на стресс (например, тепловой шок ). Кроме того, удаление нуклеосом обычно соответствовало транскрипционной активации, а замена нуклеосом обычно соответствовала транскрипционной репрессии, предположительно, потому что сайты связывания факторов транскрипции становились более или менее доступными соответственно. В целом, только одна или две нуклеосомы были перемещены на промотор, чтобы осуществить эти транскрипционные изменения. Однако даже в хромосомных регионах, которые не были связаны с транскрипционными изменениями, наблюдалось перемещение нуклеосом, что предполагает, что покрытие и раскрытие транскрипционной ДНК не обязательно производит транскрипционное событие. После транскрипции регион рДНК должен быть защищен от любых повреждений, это предполагает, что белки HMGB играют важную роль в защите региона, свободного от нуклеосом. [64] [65]
Дефекты скручивания ДНК возникают, когда добавление одной или нескольких пар оснований из одного сегмента ДНК переносится на следующий сегмент, что приводит к изменению скручивания ДНК. Это не только изменит скручивание ДНК, но и изменит ее длину. [66] Этот дефект скручивания в конечном итоге перемещается вокруг нуклеосомы посредством переноса пары оснований, это означает, что скручивания ДНК могут вызывать скольжение нуклеосомы. [67] Кристаллические структуры нуклеосомы показали, что местоположения суперспирали 2 и 5 на нуклеосоме обычно оказываются тем местом, где возникают дефекты скручивания ДНК, поскольку это общие сайты связывания ремоделеров. [68] Существует множество ремоделеров хроматина, но все они разделяют существование мотора АТФазы, который облегчает скольжение хроматина по ДНК посредством связывания и гидролиза АТФ. [69] АТФаза имеет открытое и закрытое состояние. Когда мотор АТФазы переходит из открытого в закрытое состояние, дуплекс ДНК меняет геометрию и демонстрирует наклон пары оснований. [68] Инициирование дефектов скручивания через мотор АТФазы вызывает накопление напряжения вокруг ремоделирующего сайта. Напряжение снимается, когда скольжение ДНК завершается по всей нуклеосоме через распространение двух дефектов скручивания (по одному на каждой нити) в противоположных направлениях. [69]
Нуклеосомы могут быть собраны in vitro с использованием очищенных нативных или рекомбинантных гистонов. [70] [71] Один из стандартных методов загрузки ДНК вокруг гистонов включает использование солевого диализа . Реакция, состоящая из октамеров гистонов и голой ДНК-матрицы, может быть инкубирована вместе при концентрации соли 2 М. При постоянном снижении концентрации соли ДНК будет уравновешиваться в положении, в котором она будет оборачиваться вокруг октамеров гистонов, образуя нуклеосомы. В соответствующих условиях этот процесс восстановления позволяет экспериментально картировать сродство позиционирования нуклеосомы данной последовательности. [72]
Недавний прогресс в производстве частиц ядра нуклеосомы с повышенной стабильностью включает сайт-специфические дисульфидные сшивки. [73] Две различные сшивки могут быть введены в частицу ядра нуклеосомы. Первая сшивает две копии H2A через введенный цистеин (N38C), что приводит к образованию гистонового октамера , который стабилен к потере димера H2A/H2B во время восстановления нуклеосомы. Вторая сшивка может быть введена между N-концевым хвостом гистона H3 и концами ДНК нуклеосомы через включенный конвертируемый нуклеотид. [74] Сшивка ДНК-гистонового октамера стабилизирует частицу ядра нуклеосомы против диссоциации ДНК при очень низких концентрациях частиц и при повышенных концентрациях соли.
Нуклеосомы являются основной упаковочной единицей геномной ДНК, построенной из гистоновых белков, вокруг которых закручена ДНК. Они служат в качестве каркаса для формирования структуры хроматина более высокого порядка, а также для слоя регуляторного контроля экспрессии генов. Нуклеосомы быстро собираются на вновь синтезированной ДНК позади репликационной вилки.
Гистоны H3 и H4 из разобранных старых нуклеосом сохраняются поблизости и случайным образом распределяются по вновь синтезированной ДНК. [75] Они собираются комплексом фактора сборки хроматина 1 (CAF-1), который состоит из трех субъединиц (p150, p60 и p48). [76] Недавно синтезированные H3 и H4 собираются фактором сборки репликативного сопряжения (RCAF). RCAF содержит субъединицу Asf1, которая связывается с вновь синтезированными белками H3 и H4. [77] Старые белки H3 и H4 сохраняют свои химические модификации, что способствует передаче эпигенетической сигнатуры. Недавно синтезированные белки H3 и H4 постепенно ацетилируются по разным остаткам лизина в рамках процесса созревания хроматина. [78] Также считается, что старые белки H3 и H4 в новых нуклеосомах привлекают ферменты, модифицирующие гистоны, которые маркируют новые гистоны, способствуя эпигенетической памяти.
В отличие от старых H3 и H4, старые гистоновые белки H2A и H2B высвобождаются и деградируют; поэтому вновь собранные белки H2A и H2B включаются в новые нуклеосомы. [79] H2A и H2B собираются в димеры, которые затем загружаются на нуклеосомы белком сборки нуклеосом-1 (NAP-1), который также способствует скольжению нуклеосом. [80] Нуклеосомы также разделены АТФ-зависимыми комплексами ремоделирования нуклеосом, содержащими такие ферменты, как Isw1 Ino80 и Chd1, и впоследствии собираются в структуру более высокого порядка. [81] [82]
Кристаллическая структура частицы ядра нуклеосомы ( PDB : 1EQZ [ 28] ) — различные виды, показывающие детали сворачивания и организации гистонов. Гистоны H2A , H2B , H3 , H4 и ДНК окрашены.