Оротатфосфорибозилтрансфераза ( OPRTase ) или фосфорибозилтрансфераза оротовой кислоты — фермент, участвующий в биосинтезе пиримидина . Он катализирует образование оротидин-5'-монофосфата (OMP) из оротата и фосфорибозилпирофосфата . [1] У дрожжей и бактерий оротатфосфорибозилтрансфераза является независимым ферментом с уникальным геном, кодирующим белок, тогда как у млекопитающих и других многоклеточных организмов каталитическая функция осуществляется доменом бифункционального фермента UMP-синтазы (UMPS). [2]
Поскольку OPRTase является частью бифункционального комплекса UMP-синтазы у людей, функция и стабильность этого фермента не обязательно напрямую связаны с нарушениями в организме человека. Однако разумно полагать, что дисфункция одного из ферментов вызовет дисфункцию всего фермента. [3] Дефекты в UMP-синтазе связаны с гипохромной анемией. [3] У млекопитающих этот бифункциональный фермент UMPS превращает оротовую кислоту в уридинмонофосфат (UMP). [4] Оротатфосфорибозилтрансфераза расположена в N-концевом домене UMP-синтазы . Этот процесс происходит в несколько этапов, при этом оротатфосфорибозилтрансфераза отвечает за первый этап добавления рибозного кольца к оротату . [4] На этом этапе оротовая кислота превращается в оротидилат с использованием PRPP ( фосфорибозилпирофосфата ) в качестве косубстрата. Эта реакция обусловлена гидролизом пирофосфата . [5] Оротидилатдекарбоксилаза расположена в С-концевом домене UMPS и преобразует этот промежуточный оротидилат в уридинмонофосфат (также называемый уридилатом или UMP) посредством декарбоксилирования . [4] Эти два этапа являются быстрыми и необратимыми у млекопитающих. У других пиримидиновых ауксотрофов , у которых нет этого бифункционального фермента, обычно менее сложных организмов, для проведения этой реакции требуются два отдельных фермента. [6] Как оротидилат , так и уридилат являются основными пиримидиновыми нуклеотидами , поскольку уридилат является предшественником РНК. Уридилат (UMP) позже преобразуется в UDP посредством фосфорилирования UMP -киназой и АТФ , а затем нуклеозиддифосфаткиназа обратимо фосфорилирует UDP в UTP . Затем UTP может быть аминирован посредством катализа цитидинтрифосфатсинтетазой из CTP . [ 5]
Реакция оротовой кислоты (оротата) в оротидилат катализируется оротатфосфорибозилтрансферазой с кофактором PRPP , который является кофактором , обычно используемым для синтеза нуклеотидов . Он переносит пирофосфорильные группы очень выгодно с ΔG -8,3 + 0,5 ккал/моль. [6] Два основных взаимодействия привлекают PRPP для помощи оротатфосфорибозилтрансферазе в этой реакции. Во-первых, оротатфосфорибозилтрансфераза имеет остатки аспарагиновой кислоты рядом с ее PRPP - связывающим мотивом, которые взаимодействуют с рибозил 2-/3-гидроксильными группами, которые стабилизируют движение углерода-1 связанной рибозильной группы. [6] Стабилизация происходит через сеть водородных связей этих гидроксильных групп с пирофосфатом , водой и магнием. [6] Во-вторых, боковые цепи С-конца PRPP- связывающего мотива благоприятно взаимодействуют с 5-фосфатом PRPP. [ 6]
В B. subtilis PRPP связан с этими двумя сайтами с Kd 33 мМ. Когда присутствует оротат , сродство связывания пирофосфата увеличивается в четыре раза, и реакция претерпевает взрывную кинетику с быстрым переносом фосфорибозила и затем медленным высвобождением продуктов. [7] Считается, что это медленное высвобождение происходит из-за открытой для растворителя петли оротатфосфорибозилтрансферазы, которая защищает активный сайт на первом этапе. [7] Открытие петли происходит в два этапа с неблагоприятной и медленной диссоциацией PRPP , поскольку петля закрывается в 85% случаев. [8]
Три ключевых пиримидиновых нуклеозида включают уридин , цитидин и тимидин , и они играют важную роль в биосинтезе нуклеиновых кислот, а также в метаболизме углеводов и липидов. [4] Пиримидинфосфорибозилтрансферазы, такие как оротатфосфорибозилтрансфераза, активируют свои субстраты, образуя S N 1 -подобные переходные состояния, облегчая миграцию рибозильной аномерной углеродной области в MgPP i . [9] Как и другие пиримидинфосфорибозилтрансферазы, оротатфосфорибозилтрансфераза имеет гибкую петлю, которая перемещается к позиционным группам в идеальных положениях для катализа . [4] Они также используют много молекул воды, чтобы удерживать все на месте во время реакции. [6]
Кристаллическая структура OPRTase была решена несколько раз различными научными группами. [1] [10] [11] [12] У бактерий общая структура представляет собой димер из двух субъединиц, каждая из которых состоит из семи α-спиралей и десяти β-нитей, с молекулярной массой 23919,13 Да. [13] Оротатфосфорибозилтрансфераза имеет основную часть и гибкую петлю, которая в закрытом состоянии предотвращает проникновение растворителя во время реакции. [1] У других организмов, таких как млекопитающие, насекомые и слизневидные формы, это один из доменов UMP-синтазы , а другой представляет собой оротидилатдекарбоксилазу . [14] N-конец имеет пару антипараллельных цепей с остатками, которые взаимодействуют со связанным оротатом, и Lys 26, который простирается до активного сайта и образует связь с гибкой петлей в ее закрытой форме. [6] Оротовая кислота и PRPP стабилизируются в активном центре в основном за счет водородных связей со стабилизирующими взаимодействиями от Lys 26, Phe 34 и Phe 35 к оротовой кислоте , а также от Thr 128, Ala 129, Gly 130, Ala 132, Asp 124, Lys 26 и Lys 73 к PRPP . [14] Когда Lys 26 мутирует, оротатфосфорибозилтрансфераза часто проявляет сниженную активность и специфичность. [6]
Дефекты оротатфосфорибозилтрансферазы были связаны с многочисленными медицинскими состояниями. Дефекты в домене оротатфосфорибозилтрансферазы UMPS вызывают оротовую ацидурию у людей, которая является редким наследственным метаболическим заболеванием, возникающим из-за проблем с метаболизмом пиримидина . [15] Это может привести к мегалобластной анемии и кристаллурии оротовой кислоты, которая связана с физическими и умственными нарушениями. [15] Оротовая ацидурия была впервые зарегистрирована в 1959 году, когда в моче младенца был обнаружен избыток оротовой кислоты . [6] Когда у людей есть мутация, приводящая к потере активности оротатфосфорибозилтрансферазы и, следовательно, продукции УТФ , оротовая кислота накапливается и может достигать 1,5 г/день в моче младенца. [6] Это связано с тем, что УТФ является нормальным конечным продуктом у здоровых людей в пути синтеза пиримидина и обычно регулирует этот путь. [6] Накопление оротовой кислоты может привести к образованию осадка в почках и, в конечном итоге, к почечной недостаточности. [6] Аналогично, у крупного рогатого скота голштинской породы дефицит UMPS вызван аутосомным заболеванием, которое приводит к гибели потомства на раннем эмбриональном этапе. [16]
Оротатфосфорибозилтрансфераза также является основным ферментом, участвующим в превращении 5-фторурацила в 5-F-UMP посредством фосфорибозилирования. Некоторые научные исследования показали, что оротатфосфорибозилтрансфераза потенциально может играть роль в прогностике рака. [17] Например, одно исследование показало, что соотношение экспрессии генов оротатфосфорибозилтрансферазы и дигидропиримидиндегидрогеназы влияет на прогноз пациентов с метастатическим колоректальным раком после химиотерапии на основе фторпиримидина . [17] Считается, что 5-F-UMP становится ингибитором самоубийства для тимидилатсинтетазы и играет важную роль в ингибировании роста опухоли. [17] [18] Когда пациенты с резектабельным колоректальным раком лечились пероральным 5-фторурацилом, у пациентов с высоким уровнем оротатфосфорибозилтрансферазы наблюдались значительно лучшие результаты выживания. [18] Аналогичный потенциал прогноза, основанный на уровнях и активности фосфорибозилтрансферазы оротата, был связан с карциномой мочевого пузыря и карциномой желудка . [19] [20]