Осаждение этанолом — это метод, используемый для очистки и/или концентрирования РНК , ДНК и полисахаридов , таких как пектин и ксилоглюкан, из водных растворов путем добавления этанола в качестве антирастворителя.
ДНК полярна из-за сильно заряженного фосфатного остова. Полярность делает его водорастворимым (вода полярна) по принципу «подобное растворяется в подобном» .
Из-за высокой полярности воды, о чем свидетельствует ее высокая диэлектрическая проницаемость 80,1 (при 20 ° C), электростатические силы между заряженными частицами в водном растворе значительно ниже, чем в вакууме или на воздухе.
Это соотношение отражено в законе Кулона , который можно использовать для расчета силы, действующей на два заряда , разделенных расстоянием , используя диэлектрическую проницаемость (также называемую относительной статической диэлектрической проницаемостью) среды в знаменателе уравнения ( – электрическая постоянный ):
На атомном уровне уменьшение силы, действующей на заряд, происходит за счет того, что молекулы воды образуют вокруг него гидратную оболочку . Этот факт делает воду очень хорошим растворителем для заряженных соединений, таких как соли. Электрическая сила, которая обычно удерживает кристаллы соли вместе посредством ионных связей, ослабляется в присутствии воды, позволяя ионам отделяться от кристалла и распространяться через раствор.
Тот же механизм действует в случае отрицательно заряженных фосфатных групп на остове ДНК: хотя положительные ионы присутствуют в растворе, относительно слабая результирующая электростатическая сила не позволяет им образовывать стабильные ионные связи с фосфатами и осаждаться из раствора.
Этанол гораздо менее полярен, чем вода, с диэлектрической проницаемостью 24,3 (при 25 °C). Это означает, что добавление этанола в раствор нарушает экранирование зарядов водой. Если добавить достаточное количество этанола, электрическое притяжение между фосфатными группами и любыми положительными ионами, присутствующими в растворе, становится достаточно сильным, чтобы образовывать стабильные ионные связи и осаждение ДНК. Обычно это происходит, когда этанол составляет более 64% раствора. Как предполагает механизм, для того чтобы произошло осаждение, раствор должен содержать положительные ионы; обычно эту роль играют Na + , NH4 + или Li + . [1]
ДНК осаждается, сначала гарантируя, что в растворе присутствует правильная концентрация положительных ионов (слишком большая концентрация приведет к соосаждению большого количества соли с ДНК, слишком малая - к неполному восстановлению ДНК), а затем добавление двух-трех объемов не менее 95% этанола. Многие протоколы советуют на этом этапе хранить ДНК при низкой температуре, но есть также наблюдения, что это может не улучшить восстановление ДНК и даже может снизить эффективность осаждения при инкубации в течение ночи. [2] [3] Таким образом, хорошая эффективность может быть достигнута при комнатной температуре, но если принять во внимание возможную деградацию, вероятно, лучше инкубировать ДНК на влажном льду. Оптимальное время инкубации зависит от длины и концентрации ДНК. Меньшие фрагменты и более низкие концентрации потребуют более длительного времени для достижения приемлемого восстановления. Для очень малых длин и низких концентраций рекомендуется инкубация в течение ночи. В таких случаях использование носителей, таких как тРНК , гликоген или линейный полиакриламид , может значительно улучшить выздоровление.
Во время инкубации ДНК и некоторые соли выпадают в осадок из раствора, на следующем этапе этот осадок собирают центрифугированием в микроцентрифужной пробирке на высоких скоростях (~12 000 g ). Время и скорость центрифугирования оказывают наибольшее влияние на скорость восстановления ДНК. Опять же, более мелкие фрагменты и более высокие разведения требуют более длительного и быстрого центрифугирования. Центрифугирование можно проводить либо при комнатной температуре, либо при 4 °C или 0 °C. Во время центрифугирования осажденная ДНК должна перемещаться через раствор этанола на дно пробирки, более низкие температуры увеличивают вязкость раствора, а большие объемы увеличивают расстояние, поэтому оба этих фактора снижают эффективность этого процесса, требующего более длительного центрифугирования для того же эффекта. [2] [3] После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, оставляя осадок сырой ДНК. Виден ли осадок, зависит от количества ДНК и ее чистоты (более грязные осадки легче увидеть) или от использования соосаждителей.
На следующем этапе к осадку добавляют 70% этанол и осторожно перемешивают, чтобы отделить осадок и промыть его. При этом удаляются некоторые соли, присутствующие в остаточном супернатанте и связанные с осадком ДНК, что делает окончательную очистку ДНК. Эту суспензию снова центрифугируют, чтобы еще раз осадить ДНК, и надосадочный раствор удаляют. Этот шаг повторяется один раз.
Наконец, осадок сушат на воздухе и ДНК ресуспендируют в воде или другом желаемом буфере . Важно не пересушивать осадок, так как это может привести к денатурации ДНК и затруднить ресуспендирование.
Вместо этанола также можно использовать изопропанол ; Эффективность осаждения изопропанола выше, поэтому для осаждения достаточно одного объема. Однако изопропанол менее летуч, чем этанол, и ему требуется больше времени для высыхания на воздухе на последнем этапе. Гранулы также могут менее плотно прилипать к трубке при использовании изопропанола. [1]
