Метод нарушенного полного внутреннего отражения ( НПВО ) — это метод отбора проб, используемый совместно с инфракрасной спектроскопией , который позволяет исследовать образцы непосредственно в твердом или жидком состоянии без дополнительной подготовки. [1]
НПВО использует свойство полного внутреннего отражения, приводящее к затухающей волне . Луч инфракрасного света пропускается через кристалл НПВО таким образом, что он отражается по крайней мере один раз от внутренней поверхности, контактирующей с образцом. Это отражение формирует затухающую волну, которая распространяется в образец. Глубина проникновения в образец обычно составляет от 0,5 до 2 микрометров , при этом точное значение определяется длиной волны света, углом падения и показателями преломления для кристалла НПВО и исследуемой среды. [2] Количество отражений можно изменять, изменяя угол падения. Затем луч собирается детектором, когда он выходит из кристалла. Большинство современных инфракрасных спектрометров можно переоборудовать для характеристики образцов с помощью НПВО, установив аксессуар НПВО в отсеке для образцов спектрометра. Доступность, быстрый оборот образца и простота использования НПВО с инфракрасной спектроскопией с преобразованием Фурье (ИКФП) привели к его значительному использованию научным сообществом.
Этот эффект затухания работает только в том случае, если кристалл изготовлен из оптического материала с более высоким показателем преломления , чем исследуемый образец. В противном случае свет теряется для образца. В случае жидкого образца достаточно налить небольшое количество на поверхность кристалла. В случае твердого образца образцы надежно зажимаются, чтобы обеспечить хороший контакт и удалить захваченный воздух, который может снизить интенсивность сигнала. Полученное отношение сигнал/шум зависит от количества отражений, а также от общей длины оптического пути света, который ослабляет интенсивность. Поэтому общее утверждение о том, что большее количество отражений дает лучшую чувствительность, не может быть сделано. [ необходима цитата ]
Типичные материалы для кристаллов НПВО включают германий , KRS-5 и селенид цинка , в то время как кремний идеально подходит для использования в дальней ИК-области электромагнитного спектра . Превосходные механические свойства алмаза делают его идеальным материалом для НПВО, особенно при изучении очень твердых тел, хотя широкая фононная полоса алмаза между 2600 и 1900 см −1 значительно снижает отношение сигнала к шуму в этой области. Форма кристалла зависит от типа спектрометра и природы образца. В дисперсионных спектрометрах кристалл представляет собой прямоугольную пластину со скошенными краями, показанную в поперечном сечении на иллюстрациях. Другие геометрии используют призмы, полусферы или тонкие листы. [ необходима цитата ]
Инфракрасная (ИК) спектроскопия с помощью НПВО применима к тем же химическим или биологическим системам, что и метод пропускания. Одним из преимуществ НПВО-ИК по сравнению с ИК-пропусканием является ограниченная длина пути в образец. Это позволяет избежать проблемы сильного затухания ИК-сигнала в сильно поглощающих средах, таких как водные растворы. Для ультрафиолетового или видимого света (УФ/Вид) путь затухающего света достаточно короток, так что взаимодействие с образцом уменьшается с длиной волны. Для оптически плотных образцов это может позволить проводить измерения с помощью УФ. Кроме того, поскольку не требуется устанавливать путь света, для мониторинга процесса используются одновальные зонды, которые применимы как в ближнем, так и в среднем инфракрасном спектре. [ необходима цитата ]
Недавно НПВО-ИК была применена к микрофлюидным потокам водных растворов путем разработки микрореакторов со встроенными отверстиями для кристалла НПВО, что позволяет потоку внутри микроканалов проходить через поверхность кристалла для характеризации [3] или в специальных проточных ячейках. [4] [5] Благодаря геометрии НПВО и образующейся затухающей волне с помощью этой техники можно изучать явления переноса и кинетику сорбции через тонкие пленки. [6] Возможность пассивно характеризовать образцы без подготовки образцов также привела к использованию НПВО-ИК при изучении следовых улик в судебной экспертизе .
ATR-FTIR также используется в качестве инструмента в фармакологических исследованиях для детального изучения взаимодействий белков/фармацевтических препаратов. Водорастворимые белки, которые необходимо исследовать, требуют полигистидиновых меток , позволяющих макромолекуле быть прикрепленной к липидному бислою, который прикреплен к кристаллу германия или другой подходящей оптической среде. Внутреннее отражение с нанесенным фармацевтическим препаратом или лигандом и без него даст разностные спектры для изучения конформационных изменений белков при связывании. [7]