Остановленный поток — это экспериментальный метод изучения химических реакций с полупериодом порядка 1 мс, предложенный Бриттоном Ченсом [1] [2] и расширенный Квентином Гибсоном [3] (Другие методы, такие как метод температурного скачка [4] , доступны для гораздо более быстрых процессов).
Спектрометрия с остановленным потоком позволяет изучать химическую кинетику быстрых реакций (с полупериодами порядка миллисекунд) в растворе. Сначала она использовалась в основном для изучения реакций, катализируемых ферментами. Затем остановленный поток быстро нашел свое место почти во всех биохимических, биофизических и химических лабораториях, где необходимо отслеживать химические реакции в масштабе времени миллисекунд. В своей простейшей форме остановленный поток смешивает два раствора. Небольшие объемы растворов быстро и непрерывно подаются в высокоэффективный смеситель. Затем этот процесс смешивания инициирует чрезвычайно быструю реакцию. Недавно смешанный раствор перемещается в ячейку наблюдения и выталкивает содержимое ячейки (раствор, оставшийся от предыдущего эксперимента или от необходимых этапов промывки). Время, необходимое для прохождения этого раствора от точки смешивания до точки наблюдения, известно как мертвое время. Минимальный объем инъекции будет зависеть от объема ячейки смешивания. Как только будет введено достаточно раствора для полного удаления предыдущего раствора, прибор достигает стационарного состояния, и поток может быть остановлен. В зависимости от технологии привода шприца остановка потока достигается с помощью запорного клапана, называемого жестким остановом, или с помощью стоп-шприца. Остановленный поток также посылает «стартовый сигнал» на детектор, называемый триггером, чтобы можно было наблюдать реакцию. Время срабатывания триггера обычно контролируется программным обеспечением, поэтому пользователь может запустить его одновременно с остановкой потока или за несколько миллисекунд до остановки, чтобы проверить, достигнуто ли стационарное состояние.
Два шприца заполнены растворами, которые не вступают в химическую реакцию, пока не смешаются. Они имеют поршни, которые приводятся в действие одним приводным поршнем или независимыми шаговыми двигателями, так что они соединены вместе, и их содержимое одновременно выталкивается в смесительное устройство.
После того, как два раствора выдавливаются из шприцев, они поступают в систему смешивания, которая имеет перегородки для обеспечения полного смешивания с турбулентным, а не ламинарным потоком. (Ламинарный поток позволил бы двум растворам течь бок о бок с неполным смешиванием.)
Мертвое время — это время, необходимое для того, чтобы растворы прошли от точки смешивания до точки наблюдения, это часть кинетики, которую невозможно наблюдать. Поэтому чем меньше мертвое время, тем больше информации может получить пользователь. В старых приборах это могло быть порядка 1 мс, но улучшения теперь допускают мертвое время около 0,3 мс. [5]
Смешанные реагенты проходят через ячейку наблюдения, которая позволяет отслеживать реакцию спектрофотометрически, как правило, с помощью ультрафиолетовой спектроскопии , флуоресцентной спектроскопии , кругового дихроизма или рассеяния света , и в настоящее время принято комбинировать несколько из них. [6] Кювета наблюдения с коротким путем прохождения света (от 0,75 до 1,5 мм) обычно является предпочтительной для измерений флуоресценции, чтобы уменьшить эффекты самопоглощения. Кювета наблюдения с более длинным путем прохождения света (от 0,5 см до 1 см) является предпочтительной для измерений поглощения. Современные приборы с остановленным потоком могут вмещать различные модели клеток, и можно менять кювету между двумя экспериментами. Для измерений рентгеновского излучения с остановленным потоком используется кварцевый капилляр с тонкой стенкой, чтобы минимизировать поглощение кварца. Одновременные измерения рентгеновского излучения и поглощения возможны в одном и том же капилляре.
Пройдя через ячейку наблюдения, смесь попадает в третий шприц, содержащий поршень, который приводится в действие потоком, чтобы активировать переключатель, останавливающий поток и активирующий наблюдение.
Метод остановленного потока является развитием метода непрерывного потока, который использовали Гамильтон Хартридж и Фрэнсис Рафтон [7] для изучения связывания O 2 с гемоглобином. При отсутствии какой-либо останавливающей системы реакционная смесь проходила в длинную трубку мимо системы наблюдения (состоящей в 1923 году из простого колориметра) в отходы. Перемещая колориметр вдоль трубки и зная скорость потока, Хартридж и Рафтон могли измерить процесс по истечении известного времени.
В свое время это было революционным достижением, показывающим, что, казалось бы, неразрешимая проблема (изучение процесса, занимающего миллисекунды, с оборудованием, требующим секунды для каждого измерения) может быть решена с помощью простого оборудования. Однако на практике это было ограничено реагентами, доступными в больших количествах: для белков это фактически ограничивало его реакциями гемоглобина. Для практических целей этот подход устарел.
Метод остановленного потока зависит от наличия спектроскопических свойств, которые можно использовать для отслеживания реакции. Когда это не так, гасящий поток обеспечивает альтернативу, которая использует традиционные химические методы анализа. [8] Вместо механической системы остановки реакция останавливается гашением , продукты доставляются к получателю, который немедленно останавливает реакцию, либо путем мгновенного замораживания, либо путем денатурации фермента химическим денатурантом или подвергая образец воздействию денатурирующего источника света. Как и в методе непрерывного потока, время между смешиванием и гашением можно изменять, изменяя длину трубки.
Метод импульсного гасящего потока, предложенный Аланом Ферштом и Россом Джейксом [9], устраняет необходимость в длинной трубке. Реакция инициируется точно так же, как в эксперименте с остановленным потоком, но есть третий шприц, который обеспечивает гашение через определенное и заданное время после инициирования.
Поглощенный поток имеет как преимущества, так и недостатки по сравнению с остановленным потоком. С одной стороны, химический анализ позволяет понять, какой процесс измеряется, тогда как не всегда может быть очевидно, какой процесс представляет спектроскопический сигнал. С другой стороны, погашенный поток гораздо более трудоемок, поскольку каждая точка на протяжении временного хода должна определяться отдельно. Изображение слева для катализа нитрогеназой из Klebsiella pneumoniae [10] иллюстрирует оба этих момента: согласие по половинному времени указывает на то, что поглощение при 420 нм измеряло высвобождение Pi , но эксперимент с погашенным потоком потребовал 11 точек данных.