пара -нитрофенилфосфат ( pNPP ) — небелковый хромогенный субстрат для щелочных и кислых фосфатаз, используемых в ИФА и обычных спектрофотометрических анализах. [1] Фосфатазы катализируют гидролиз pNPP, высвобождая неорганический фосфат и сопряженное основание пара -нитрофенола (pNP). Полученный фенолят имеет желтый цвет и максимальное поглощение при 405 нм. [2] Это свойство можно использовать для определения активности различных фосфатаз, включая щелочную фосфатазу (AP) и протеинтирозинфосфатазу (PTP). [3]
PNPP классифицируется как хромогенный субстрат из-за его способности превращаться из бесцветного соединения в окрашенное соединение посредством биологического механизма, дефосфорилирования. [4] PNPP используется из-за его низкой стоимости, а скорость реакций может быть измерена в широком диапазоне концентраций субстрата, поскольку концентрация субстрата не является ограничивающим фактором в реакции. Ограничения PNPP заключаются в том, что это небольшая молекула и, возможно, не полностью отражает условия и структуры, которые встречаются физиологически. [5]
Анализ PNPP включает смешивание образца со смесью, содержащей PNPP, и предоставление реакции возможности протекать в течение заранее определенного периода времени. После этого момента процесс останавливается путем добавления стоп-раствора, часто приготовленного из сильной щелочи, такой как гидроксид натрия. [6]
Вещество чувствительно к свету, поэтому его следует хранить в защищенном от света месте. Это также важно после добавления субстрата в смесь и перед считыванием. Оптимальная температура хранения — −20 °C. [7]
Чтобы получить точные и достоверные результаты, параметры анализа должны тщательно регулироваться, поскольку реакция чувствительна к таким факторам, как pH, температура и различная степень ингибиторов или стимуляторов. [8]