Пептидная массовая дактилоскопия ( PMF ), также известная как белковая дактилоскопия , представляет собой аналитический метод идентификации белков , при котором неизвестный интересующий белок сначала расщепляется на более мелкие пептиды , абсолютные массы которых можно точно измерить с помощью масс-спектрометра, такого как MALDI-TOF или ESI-TOF . [1] Метод был разработан в 1993 году несколькими группами независимо. [2] [3] [4] [5] [6] Массы пептидов сравниваются либо с базой данных, содержащей известные белковые последовательности, либо даже с геномом. Это достигается с помощью компьютерных программ, которые переводят известный геном организма в белки, затем теоретически разрезают белки на пептиды и вычисляют абсолютные массы пептидов из каждого белка. Затем они сравнивают массы пептидов неизвестного белка с теоретическими массами пептидов каждого белка, закодированного в геноме. Результаты статистически анализируются для поиска наилучшего соответствия.
Преимущество этого метода в том, что должны быть известны только массы пептидов. Недостатком является то, что последовательность белка должна присутствовать в интересующей базе данных. Кроме того, большинство алгоритмов PMF предполагают, что пептиды происходят из одного белка. [7] Наличие смеси может значительно усложнить анализ и потенциально поставить под угрозу результаты. Типичным для идентификации белка на основе PMF является требование изолированного белка. Смеси, превышающие количество белков 2–3, как правило, требуют дополнительного использования идентификации белка на основе MS/MS для достижения достаточной специфичности идентификации. Поэтому типичные образцы PMF представляют собой изолированные белки из двумерного гель-электрофореза (2D-гели) или изолированные полосы SDS-PAGE . Дополнительные анализы с помощью MS/MS могут быть либо прямыми, например, анализ MALDI-TOF/TOF, либо последующим анализом nanoLC-ESI-MS/MS элюатов пятен геля. [7] [8]
Из-за длительного, утомительного процесса анализа белков был разработан метод пептидной массовой дактилоскопии. Деградация Эдмана использовалась в анализе белков, и для анализа одного аминокислотного остатка требовался почти час. [9] SDS-PAGE также использовался для разделения белков в очень сложных смесях, которые также использовали методы электроблоттинга и окрашивания. [10] Затем полосы извлекались из геля и автоматически секвенировались. Повторяющейся проблемой в этом процессе было то, что мешающие белки также очищались с интересующим белком. Последовательности этих мешающих белков были скомпилированы в то, что стало известно как база данных Dayhoff. [11] В конечном итоге, наличие последовательностей этих известных белковых загрязнителей в базах данных сократило время работы прибора и расходы, связанные с анализом белков.
Образцы белков могут быть получены из SDS-PAGE [7] или обращенно-фазовой HPLC , а затем подвергнуты некоторым химическим модификациям. Дисульфидные мостики в белках восстанавливаются, а аминокислоты цистеина химически карбамидометилируются или акриламидируются во время гель-электрофореза.
Затем белки разрезаются на несколько фрагментов с использованием протеолитических ферментов, таких как трипсин , химотрипсин или Glu-C . Типичное соотношение образца и протеазы составляет 50:1. Протеолиз обычно проводится в течение ночи, а полученные пептиды экстрагируются ацетонитрилом и высушиваются в вакууме. Затем пептиды растворяются в небольшом количестве дистиллированной воды или дополнительно концентрируются и очищаются и готовы к масс-спектрометрическому анализу.
Расщепленный белок можно анализировать с помощью различных типов масс-спектрометров, таких как ESI-TOF или MALDI-TOF . MALDI-TOF часто является предпочтительным инструментом, поскольку он обеспечивает высокую пропускную способность образца, и несколько белков могут быть проанализированы в одном эксперименте, если его дополнить анализом MS/MS . LC/ESI-MS и CE/ESI-MS также являются отличными методами для пептидного массового отпечатка пальцев. [12] [13]
Небольшая часть пептида (обычно 1 микролитр или меньше) пипетируется на мишень MALDI, и к пептидной смеси добавляется химическое вещество, называемое матрицей . Обычными матрицами являются синапиновая кислота , альфа-циано-4-гидроксикоричная кислота и 2,3-дигидроксибензойная кислота . Молекулы матрицы необходимы для десорбции молекул пептида. Молекулы матрицы и пептида сокристаллизуются на мишени MALDI и готовы к анализу. Существует одна преимущественно методика подготовки образцов MALDI-MS, а именно методика высушенных капель. [14] Мишень вставляется в вакуумную камеру масс-спектрометра, и десорбция и ионизация фрагментов полипептида инициируются импульсным лазерным лучом, который передает большое количество энергии молекулам матрицы. Передача энергии достаточна для содействия ионизации и переходу молекул матрицы и пептидов из твердой фазы в газовую фазу. Ионы ускоряются в электрическом поле масс-спектрометра и летят к ионному детектору, где их прибытие регистрируется как электрический сигнал. Их отношение массы к заряду пропорционально их времени пролета (TOF) в дрейфовой трубке и может быть рассчитано соответствующим образом.
Сочетание ESI с капиллярной ЖХ позволяет отделить пептиды от белковых гидролизатов, одновременно получая их молекулярные массы. [15] Капиллярный электрофорез в сочетании с ESI-MS — это еще один метод; однако он лучше всего работает при анализе небольших количеств белков. [13]
Масс-спектрометрический анализ выдает список молекулярных масс, который часто называют списком пиков. Массы пептидов сравниваются с базами данных белков, такими как Swissprot , которые содержат информацию о последовательности белков. Программное обеспечение выполняет in silico -переваривание белков в базе данных с тем же ферментом (например, трипсином), который используется в реакции химического расщепления. Затем вычисляется масса этих пептидов и сравнивается со списком пиков измеренных масс. Результаты статистически анализируются, и возможные совпадения возвращаются в таблице результатов.