Обратная связь транскрипции-трансляции ( TTFL ) — это клеточная модель для объяснения циркадных ритмов в поведении и физиологии . Широко распространенная среди видов, TTFL является ауторегуляторной, в которой транскрипция часовых генов регулируется их собственными белковыми продуктами.
Циркадные ритмы были задокументированы на протяжении столетий. Например, французский астроном Жан-Жак д'Орту де Меран заметил периодическое 24-часовое движение листьев мимозы еще в 1729 году. Однако наука только недавно начала раскрывать клеточные механизмы, ответственные за управление наблюдаемыми циркадными ритмами. Клеточная основа циркадных ритмов подтверждается тем фактом, что ритмы наблюдались у одноклеточных организмов [1]
Начиная с 1970-х годов эксперименты, проведенные Роном Конопкой и коллегами, в которых использовались методы прямой генетики для индукции мутации, показали, что образцы Drosophila melanogaster с измененными генами периода ( Per ) также демонстрировали измененную периодичность. По мере совершенствования экспериментальных инструментов генетики и молекулярной биологии исследователи дополнительно идентифицировали гены, участвующие в поддержании нормального ритмического поведения, что привело к возникновению концепции о том, что внутренние ритмы изменяются небольшим подмножеством основных генов часов. Хардин и коллеги (1990) были первыми, кто предположил, что механизм, управляющий этими ритмами, представляет собой отрицательную обратную связь. Последующие крупные открытия подтвердили эту модель; в частности, эксперименты, проведенные Томасом К. Дарлингтоном и Николасом Гекакисом в конце 1990-х годов, которые идентифицировали белки часов и охарактеризовали их методы у Drosophila и мышей соответственно. Эти эксперименты дали начало модели обратной связи транскрипции-трансляции (TTFL), которая теперь стала доминирующей парадигмой для объяснения циркадного поведения у широкого спектра видов. [2]
TTFL представляет собой отрицательную обратную связь , в которой часовые гены регулируются их белковыми продуктами. Как правило, TTFL включает в себя два основных рычага: положительные регуляторные элементы, которые способствуют транскрипции , и белковые продукты, которые подавляют транскрипцию. Когда положительный регуляторный элемент связывается с промотором часового гена , транскрипция продолжается, что приводит к созданию транскрипта мРНК , а затем продолжается трансляция , что приводит к белковому продукту. Существуют характерные задержки между накоплением транскрипта мРНК, накоплением белка и подавлением гена из-за динамики трансляции, посттрансляционной модификации белка , димеризации белка и внутриклеточного перемещения в ядро . [3] У разных видов белки, участвующие в TTFL, содержат общие структурные мотивы, такие как домены PAS , участвующие во взаимодействиях белок-белок, и домены bHLH , участвующие в связывании ДНК. [4]
Как только в цитоплазме накапливается достаточно модифицированных белковых продуктов , они транспортируются в ядро, где они ингибируют положительный элемент от промотора, чтобы остановить транскрипцию часовых генов. Таким образом, часовой ген транскрибируется на низких уровнях, пока его белковые продукты не деградируют, что позволяет положительным регуляторным элементам связываться с промотором и перезапускать транскрипцию. Отрицательная обратная связь TTFL имеет несколько свойств, важных для клеточных циркадных часов. Во-первых, она приводит к суточным ритмам как в транскрипции генов, так и в обилии и размере белка, вызванным задержкой между трансляцией и отрицательной регуляцией гена. Период цикла или время, необходимое для завершения одного цикла, остается постоянным у каждого человека и, за исключением мутаций, обычно составляет около 24 часов. Это обеспечивает стабильное вовлечение в 24-часовой цикл света и темноты, который переживает Земля. Кроме того, белковые продукты часовых генов контролируют нижестоящие гены, которые не являются частью петли обратной связи, позволяя часовым генам создавать суточные ритмы в других процессах, таких как метаболизм, внутри организма. [3] Наконец, TTFL является предельным циклом, то есть это замкнутый контур, который вернется к своей фиксированной траектории, даже если он будет нарушен, поддерживая колебательный путь в течение фиксированного 24-часового периода. [5]
Наличие TTFL в высокой степени сохраняется у разных видов животных; однако многие из участников процесса менялись в ходе эволюции у разных видов. Существуют различия в генах и белках, участвующих в TTFL, при сравнении растений, животных, грибов и других эукариот. Это говорит о том, что часы, которые следуют модели TTFL, эволюционировали несколько раз за время существования жизни. [6]
TTFL был впервые обнаружен у Drosophila , и система разделяет несколько компонентов с TTFL млекопитающих. Транскрипция генов часов, Period (per) и Timeless (tim) , инициируется, когда положительные элементы Cycle (dCYC) и Clock (dCLK) образуют гетеродимер и связывают промоторы E-box , инициируя транскрипцию. В течение дня TIM деградирует; воздействие света облегчает связывание CRY с TIM, что приводит к убиквитинированию TIM и последующей деградации. [7] Ночью TIM и PER способны образовывать гетеродимеры и медленно накапливаться в цитоплазме, где PER фосфорилируется киназой DOUBLETIME (DBT). Посттранскрипционная модификация множественных фосфатных групп как нацеливает комплекс на деградацию, так и облегчает ядерную локализацию. В ядре димер PER-TIM связывается с димером CYC-CLK, что заставляет димер CYC-CLK высвобождаться из E-boxes и подавлять транскрипцию. После того, как PER и TIM деградируют, димеры CYC-CLK способны снова связывать E-boxes, чтобы инициировать транскрипцию, замыкая петлю отрицательной обратной связи. [8]
Вторичные петли обратной связи взаимодействуют с этой первичной петлей обратной связи. CLOCKWORK ORANGE (CWO) связывает E-boxes, чтобы действовать как прямой конкурент CYC-CLK, тем самым ингибируя транскрипцию. PAR-DOMAIN PROTEIN 1 ε (PDP1ε) является активатором обратной связи, а VRILLE (VRI) является ингибитором обратной связи промотора Clk, и их экспрессия активируется dCLK-dCYC. Экдизон-индуцированный белок 75 (E75) ингибирует экспрессию clk и tim -зависимо активирует транскрипцию per . Все эти вторичные петли действуют, чтобы усилить первичный TTFL. [8]
Криптохром у дрозофилы представляет собой фоторецептор синего света, который запускает деградацию TIM, косвенно приводя к сбросу фазы часов и возобновлению стимуляции экспрессии per . [8]
Модель TTFL млекопитающих содержит много компонентов, которые являются гомологами тех, что обнаружены у Drosophila . Система млекопитающих работает так, что BMAL1 образует гетеродимер с CLOCK для инициирования транскрипции mPer и криптохрома ( cry ). Существует три паралога, или исторически схожих гена, которые теперь появляются как дупликация гена period у млекопитающих, перечисленных как mPer1 , mPer2 и mPer3 . Существует также два паралога криптохрома у млекопитающих. Белки PER и CRY образуют гетеродимер, а фосфорилирование PER с помощью CK1δ и CK1ε регулирует локализацию димера в ядре. В ядре PER-CRY отрицательно регулирует транскрипцию своих родственных генов, связывая BMAL1-CLOCK и вызывая их высвобождение из промотора E-box. [8]
Хотя паралоги mPer работают вместе как функциональный ортолог dPer , каждый из них имеет свою отличительную функцию. mPer1 и mPer2 необходимы для функции часов в мозге, в то время как mPer3 играет заметную роль только в циркадных ритмах периферических тканей. Нокаутирование mPer1 или mPer2 вызывает изменение периода, при этом нокауты mPer1 свободно бегут с более коротким периодом, а нокауты mPer2 свободно бегут с более длинным периодом по сравнению с исходным тау, прежде чем в конечном итоге стать аритмичными. Аналогично, нокауты mCry1 приводят к сокращению периода, а нокауты mCry2 приводят к удлинению периода, с двойным mCry1 /m Нокауты Cry2 приводят к аритмичности. [8]
У млекопитающих также есть вторичные петли, хотя они более сложны, чем те, что наблюдаются у Drosophila . Подобно CWO у Drosophila , Deleted при раке пищевода1,2 (Dec1 Dec2) подавляют экспрессию mPer , связывая E-boxes, что не позволяет CLOCK-BMAL1 связываться с их мишенями. Рецепторы REV-ERB и связанный с ретиноевой кислотой орфанный рецептор (ROR) играют аналогичную роль PDP1ε и VRI у Drosophila , за исключением того, что они регулируют связывающего партнера CLOCK BMAL1 вместо того, чтобы напрямую регулировать CLOCK. D-сайт-связывающий белок (DBP) и E4-связывающий белок (E4BP4) связываются с последовательностью промотора D-Box, чтобы регулировать экспрессию mPer . [8]
То, как эти гены связаны с Drosophila melanogaster , видно по функции каждого из генов и по тому, как они эволюционно изменились. BMAL1 является ортологом CYCLE . Это означает, что BMAL1 и CYCLE, по-видимому, имеют общую историю, но встречаются у разных видов. Другой пример параллелей между Drosophila melanogaster и млекопитающими также виден в cry и mPer, поскольку они являются функциональными ортологами per и tim . [8]
Ген частоты ( frq ) в Neurospora был идентифицирован как второй известный часовой ген в 1979 году Дж. Ф. Фельдманом и его коллегами. Frq был впервые клонирован в 1989 году CR McClung и его коллегами. Этот ген представлял особый интерес, поскольку его экспрессия очень сложна по сравнению с другими известными микробными генами. Два положительных регуляторных белка, White Collar-1 (WC-1) и White Collar-2 (WC-2), связывают промотор frq, который называется Clock Box, во время поздней субъективной ночи для активации транскрипции. Свет также важен для индукции экспрессии FRQ; WC-1 является фотопигментом, и свет позволяет WC-1 и WC-2 связывать другой промотор, называемый проксимальным элементом светочувствительности (PLRE). Белок FRQ отрицательно регулирует активность WC-1 и WC-2. Несколько киназ (CK1, CK2 и PRD-4/киназа контрольной точки 2) и фосфатазы (PP1 и PP2A) регулируют способность FRQ транслоцироваться в ядро и стабильность FRQ, WC-1 и WC-2. [9]
Первая модель TTFL была предложена для Arabidopsis thaliana в 2001 году и включала два фактора транскрипции MYB, LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY), CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) и TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (TOC1). CCA1 и LHY экспрессируются утром и взаимодействуют друг с другом, подавляя экспрессию TOC1. Экспрессия CCA1 и LHY снижается в темноте, что позволяет TOC1 экспрессировать и негативно регулировать экспрессию CCA1 и LHY. CCA1 и LHY также могут связываться со своим собственным промотором, чтобы подавлять собственную транскрипцию. [10]
Вторая петля существует с участием PRR9, PRR7 и PRR5, которые являются гомологами TOC1 и подавляют экспрессию CCA1 и LHY. Эти гены PRR напрямую подавляются LHY и TOC1. Эти гены также регулируются «вечерним комплексом» (EC), который образован LUX ARRHYTHMO (LUX), EARLY FLOWERING 3 (ELF3) и EARLY FLOWERING 4 (ELF4). LUX является фактором транскрипции с функцией, аналогичной MYB, в то время как ELF3 и ELF4 являются ядерными белками, функции которых неизвестны. «Вечерний комплекс» косвенно способствует экспрессии LHY и CCA1, которые подавляют транскрипцию своих собственных компонентов. Поскольку эта модель состоит из двух ингибирований, приводящих к активации, ее также называют репрессилятором. [10]
Недавно обнаруженная петля включает семейство генов reveille ( reveille ), которые экспрессируются утром и вызывают транскрипцию вечерних генов, таких как PRR5, TOC1, LUX и ELF4. После того, как полученные белки транслируются, PRR9, PRR7 и PRR5 подавляют RVE8. RVE8 также взаимодействует с утренними компонентами NIGHT LIGHT-INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED (LNK1, 2, 3 и 4), причем LNK либо антагонизируют, либо коактивируют RVE8. [10]
Хотя GIGANTEA (GI) не известна как основная часть модели Arabdopsis TTFL, она подавляется CCA1, LHY и TOC1. Кроме того, GI активирует экспрессию CCA1 и LHY. [10]
Исследования часов цианобактерий привели к открытию трех основных генов часов: KaiA , KaiB и KaiC . Первоначально считалось, что эти белки следуют модели TTFL, аналогичной предложенной для эукариот , поскольку существовал ежедневный шаблон в мРНК и обилии белков и уровне фосфорилирования, отрицательная обратная связь белков с их родственными генами, сброс фазы часов в ответ на сверхэкспрессию KaiC и измененная активность Kai посредством взаимодействий друг с другом. [11] Каждый из этих результатов согласуется с пониманием TTFL в то время. Однако более поздние исследования с тех пор пришли к выводу, что посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование, более важны для контроля часов. Когда промоторы для белков Kai были заменены неспецифическими промоторами, не было прерывания центральной петли обратной связи, как можно было бы ожидать, если бы ингибирование происходило через обратную связь белков с их специфическими промоторами. Как следствие, модель TTFL в значительной степени была определена как неточная для цианобактерий; Транскрипционная регуляция не является центральным процессом, управляющим ритмами цианобактерий. Хотя транскрипционная и трансляционная регуляция присутствуют, они считались эффектами часов, а не необходимыми для функционирования часов. [12]
Также были обнаружены посттрансляционные петли обратной связи (PTFL), участвующие в регуляции часовых генов, часто работающие в тандеме с моделью TTFL. Как у млекопитающих, так и у растений посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование и ацетилирование, регулируют обилие и/или активность часовых генов и белков. Например, было показано, что уровни фосфорилирования компонентов TTFL изменяются ритмично. Эти посттрансляционные модификации могут служить сигналами деградации, регуляторами связывания и сигналами для привлечения дополнительных факторов. [13]
Примечательно, что цианобактерии демонстрируют ритмичные 24-часовые изменения фосфорилирования в петле обратной связи, которая не зависит от транскрипции и трансляции: циркадные ритмы фосфорилирования наблюдаются, когда белки Kai петли обратной связи помещаются в пробирку с АТФ, независимо от любого другого клеточного механизма. Эта трехбелковая посттрансляционная система широко признана основным осциллятором, необходимым и достаточным для управления суточным ритмом. [14] В дополнение к системе Kai у цианобактерий было показано, что окисление белков пероксиредоксина происходит независимо от транскрипции и трансляции как в эритроцитах млекопитающих, так и в клетках водорослей Ostreococcus tauri ; эта система, как было замечено, сохраняется во многих организмах. [15] Неясно, взаимодействует ли система пероксиредоксина с часами на основе TTFL или сама является частью новых часов на основе PTFL. Однако оба эти открытия подразумевают, что в некоторых организмах или типах клеток PTFL достаточны для управления циркадными ритмами.