stringtranslate.com

Пиросеквенирование

Пиросеквенирование — метод секвенирования ДНК (определение порядка нуклеотидов в ДНК), основанный на принципе «секвенирования путем синтеза», при котором секвенирование осуществляется путем обнаружения включенного нуклеотида ДНК-полимеразой . Пиросеквенирование основано на обнаружении света на основе цепной реакции при высвобождении пирофосфата . Отсюда и название — пиросеквенирование.

Принцип пиросеквенирования был впервые описан в 1993 году [1] Бертилем Петтерссоном, Матиасом Уленом и Полом Нюреном путем объединения метода твердофазного секвенирования [2] с использованием покрытых стрептавидином магнитных шариков с рекомбинантной ДНК-полимеразой, не обладающей 3´-5´экзонуклеазной активностью (корректура) и люминесцентной детекцией с использованием фермента люциферазы светлячка . [3] Смесь трех ферментов ( ДНК-полимераза , АТФ -сульфурилаза и люцифераза светлячка ) и нуклеотид ( dNTP ) добавляются к одноцепочечной ДНК, подлежащей секвенированию, и включение нуклеотида сопровождается измерением испускаемого света. Интенсивность света определяет, было ли включено 0, 1 или более нуклеотидов, тем самым показывая, сколько комплементарных нуклеотидов присутствует на шаблонной нити. Нуклеотидная смесь удаляется перед добавлением следующей нуклеотидной смеси. Этот процесс повторяется с каждым из четырех нуклеотидов до тех пор, пока не будет определена последовательность ДНК одноцепочечной матрицы.

Второй метод пиросеквенирования на основе раствора был описан в 1998 году [4] Мостафой Ронаги , Матиасом Уленом и Полом Нюреном . В этом альтернативном методе вводится дополнительный фермент апираза для удаления нуклеотидов, которые не включены ДНК-полимеразой. Это позволило добавлять смесь ферментов, включающую ДНК -полимеразу , люциферазу и апиразу, в начале и сохранять ее на протяжении всей процедуры, тем самым обеспечивая простую настройку, пригодную для автоматизации. Автоматизированный прибор, основанный на этом принципе, был представлен на рынке в следующем году компанией Pyrosequencing.

Третий микрофлюидный вариант метода пиросеквенирования был описан в 2005 году [5] Джонатаном Ротбергом и его коллегами из компании 454 Life Sciences . Этот альтернативный подход к пиросеквенированию был основан на оригинальном принципе прикрепления ДНК, подлежащей секвенированию, к твердой подложке, и они показали, что секвенирование может быть выполнено в высокопараллельном режиме с использованием микроизготовленного микрочипа . Это позволило проводить высокопроизводительное секвенирование ДНК, и на рынок был выведен автоматизированный инструмент. Это стало первым инструментом для секвенирования следующего поколения, положившим начало новой эре в геномных исследованиях, с быстро падающими ценами на секвенирование ДНК, что позволило проводить секвенирование всего генома по доступным ценам.

Процедура

Как работает пиросеквенирование
На схеме показано, как работает пиросеквенирование.

«Секвенирование синтезом» подразумевает взятие одной цепи ДНК для секвенирования и последующий синтез ее комплементарной цепи ферментативным путем. Метод пиросеквенирования основан на обнаружении активности ДНК-полимеразы (фермента, синтезирующего ДНК) с другим хемолюминесцентным ферментом . По сути, метод позволяет секвенировать одну цепь ДНК , синтезируя комплементарную цепь вдоль нее, по одной паре оснований за раз, и обнаруживая, какое основание было фактически добавлено на каждом этапе. Шаблон ДНК неподвижен, и растворы нуклеотидов A, C, G и T последовательно добавляются и удаляются из реакции. Свет вырабатывается только тогда, когда раствор нуклеотида дополняет первое неспаренное основание шаблона. Последовательность растворов, которые производят хемолюминесцентные сигналы, позволяет определить последовательность шаблона. [6]

Для варианта пиросеквенирования на основе раствора шаблон одноцепочечной ДНК ( ssDNA ) гибридизуется с праймером секвенирования и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой , АТФ-сульфурилазой , люциферазой и апиразой , а также с субстратами аденозин-5´-фосфосульфатом (APS) и люциферином .

  1. Добавление одного из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов ( dNTP ) (dATPαS, который не является субстратом для люциферазы, добавляется вместо dATP, чтобы избежать шума) инициирует второй шаг. ДНК-полимераза включает правильные, комплементарные dNTP в шаблон. Это включение высвобождает пирофосфат (PPi).
  2. Сульфурилаза АТФ преобразует PPi в АТФ в присутствии аденозин-5´ фосфосульфата. Этот АТФ действует как субстрат для люциферазно-опосредованного преобразования люциферина в оксилюциферин, который генерирует видимый свет в количествах, пропорциональных количеству. Свет, производимый в реакции, катализируемой люциферазой, обнаруживается камерой и анализируется в программе.
  3. Невключенные нуклеотиды и АТФ расщепляются апиразой , и реакция может возобновиться с другим нуклеотидом.

Процесс можно представить следующими уравнениями:

где:

Ограничения

В настоящее время ограничением метода является то, что длина отдельных прочтений последовательности ДНК находится в районе 300-500 нуклеотидов, что короче, чем 800-1000, которые можно получить с помощью методов терминации цепи (например, секвенирования по Сэнгеру). Это может затруднить процесс сборки генома , особенно для последовательностей, содержащих большое количество повторяющейся ДНК . Отсутствие корректурной активности ограничивает точность этого метода.

Коммерциализация

Компания Pyrosequencing AB в Уппсале, Швеция, была основана с венчурным капиталом , предоставленным HealthCap, с целью коммерциализации оборудования и реагентов для секвенирования коротких участков ДНК с использованием техники пиросеквенирования. Pyrosequencing AB была зарегистрирована на Стокгольмской фондовой бирже в 1999 году. Она была переименована в Biotage в 2003 году. [7] Бизнес-направление пиросеквенирования было приобретено Qiagen в 2008 году. Технология пиросеквенирования была дополнительно лицензирована 454 Life Sciences . 454 разработала технологию пиросеквенирования на основе массива, которая возникла как платформа для крупномасштабного секвенирования ДНК , включая секвенирование генома и метагеномику .

Компания Roche объявила о прекращении поддержки платформы секвенирования 454 в 2013 году. [8]

Ссылки

  1. ^ Нюрен, Петтерссон и Улен (1993) «Твердофазное минисеквенирование ДНК с помощью ферментативного люминометрического анализа неорганического пирофосфата» Аналитическая биохимия 208 (1), 171-175, https://doi.org/10.1006/abio.1993.1024
  2. ^ Улен (1989) «Магнитное разделение ДНК» Nature 340: 733-4, https://doi.org/10.1038/340733a0
  3. ^ Найрен и Лундин (1985) «Ферментативный метод непрерывного мониторинга синтеза неорганического пирофосфата» Аналитическая биохимия 151 (2): 504-509. https://doi.org/10.1016/0003-2697(85)90211-8
  4. ^ Ронаги, Мостафа; Улен, Матиас; Нюрен, Пол (17 июля 1998 г.). «Метод секвенирования на основе пирофосфата реального времени». Наука . 281 (5375): 363–365. дои : 10.1126/science.281.5375.363. PMID  9705713. S2CID  26331871.
  5. ^ Маргилес и др. (2005) «Секвенирование генома в микроизготовленных пиколитровых реакторах высокой плотности» Nature 437, 376-380. https://doi.org/doi:10.1038/nature03959;
  6. ^ QIAGEN. "Обзор технологии и платформы пиросеквенирования" . Получено 4 августа 2017 г.
  7. ^ Biotage. "История Biotage". www.biotage.com . Получено 19 сентября 2022 г.
  8. ^ Холлмер, Марк (17 октября 2013 г.). «Roche закрывает 454 Life Sciences, поскольку она снижает фокус на секвенировании генов». Fierce Biotech .

Дальнейшее чтение