ДНК-футпринтинг — это метод исследования специфичности последовательности ДНК -связывающих белков in vitro. Этот метод может быть использован для изучения взаимодействия белок-ДНК как вне, так и внутри клеток.
Регуляция транскрипции была тщательно изучена, и все же многое еще неизвестно. Факторы транскрипции и связанные с ними белки, которые связывают промоторы , энхансеры или сайленсеры для управления или подавления транскрипции, имеют основополагающее значение для понимания уникальной регуляции отдельных генов в геноме . Такие методы, как ДНК-отпечатки, помогают выяснить, какие белки связываются с этими связанными областями ДНК, и раскрыть сложности контроля транскрипции.
В 1978 году Дэвид Дж. Галас и Альберт Шмитц разработали метод ДНК-отпечатков для изучения специфичности связывания белка-репрессора lac. Первоначально это была модификация метода химического секвенирования Максама-Гилберта. [1]
Простейшим применением этого метода является оценка того, связывается ли данный белок с интересующей областью в молекуле ДНК. [2] Полимеразная цепная реакция (ПЦР) амплифицирует и маркирует интересующую область, которая содержит потенциальный сайт связывания белка, в идеале ампликон имеет длину от 50 до 200 пар оснований. Добавьте интересующий белок к части меченой ДНК-матрицы; часть должна оставаться отдельной без белка для последующего сравнения. Добавьте расщепляющий агент к обеим частям ДНК-матрицы. Расщепляющий агент — это химическое вещество или фермент, который будет резать в случайных местах независимо от последовательности. Реакция должна происходить достаточно долго, чтобы разрезать каждую молекулу ДНК только в одном месте. Белок, который специфически связывает область в ДНК-матрице, защитит ДНК, с которой он связан, от расщепляющего агента. Запустите оба образца бок о бок на электрофорезе в полиакриламидном геле . Часть ДНК-матрицы без белка будет разрезана в случайных местах, и, таким образом, при запуске в геле будет получено распределение, похожее на лестницу. ДНК-матрица с белком приведет к лестничному распределению с разрывом в нем, "отпечатку", где ДНК защищена от расщепляющего агента. Примечание: химическое секвенирование ДНК Максама-Гилберта можно проводить вместе с образцами на полиакриламидном геле, чтобы предсказать точное местоположение сайта связывания лиганда.
ДНК-шаблон, помеченный на 3' или 5' конце, в зависимости от расположения сайта(ов) связывания. Метки, которые можно использовать: радиоактивность и флуоресценция . Радиоактивность традиционно использовалась для маркировки фрагментов ДНК для анализа футпринтинга, поскольку метод был первоначально разработан на основе метода химического секвенирования Максама-Гилберта. Радиоактивная маркировка очень чувствительна и оптимальна для визуализации небольших количеств ДНК. Флуоресценция является желательным достижением из-за опасностей использования радиохимикатов. Однако ее было сложнее оптимизировать, поскольку она не всегда достаточно чувствительна для обнаружения низких концентраций целевых цепей ДНК, используемых в экспериментах по футпринтингу ДНК. Электрофоретические секвенирующие гели или капиллярный электрофорез были успешными в анализе футпринтинга флуоресцентно меченых фрагментов. [2]
Можно выбрать различные расщепляющие агенты. Желаемый агент — это тот, который нейтрален к последовательности, прост в использовании и легко контролируется. К сожалению, ни один из доступных агентов не соответствует всем этим стандартам, поэтому можно выбрать подходящий агент в зависимости от последовательности ДНК и интересующего лиганда. Подробно описаны следующие расщепляющие агенты: ДНКаза I — это большой белок, который функционирует как двухцепочечная эндонуклеаза . Он связывается с малой бороздкой ДНК и расщепляет фосфодиэфирный остов. Это хороший расщепляющий агент для футпринтинга, поскольку его размер делает его легко физически затрудненным. Таким образом, более вероятно, что его действие будет заблокировано связанным белком на последовательности ДНК. Кроме того, фермент ДНКаза I легко контролируется добавлением ЭДТА для остановки реакции. Однако существуют некоторые ограничения в использовании ДНКазы I. Фермент не разрезает ДНК случайным образом; на его активность влияет локальная структура и последовательность ДНК, и поэтому получается неровная лестница. Это может ограничить точность прогнозирования сайта связывания белка с молекулой ДНК. [2] [3] Гидроксильные радикалы создаются в результате реакции Фентона , которая включает восстановление Fe 2+ с помощью H 2 O 2 с образованием свободных гидроксильных молекул. Эти гидроксильные молекулы реагируют с остовом ДНК, что приводит к разрыву. Благодаря своему небольшому размеру полученный отпечаток ДНК имеет высокое разрешение. В отличие от ДНКазы I они не зависят от последовательности и приводят к гораздо более равномерно распределенной лестнице. Отрицательным аспектом использования гидроксильных радикалов является то, что их использование требует больше времени из-за более медленной реакции и времени переваривания. [4] Ультрафиолетовое облучение может использоваться для возбуждения нуклеиновых кислот и создания фотореакций, что приводит к повреждению оснований в цепи ДНК. [5] Фотореакции могут включать: разрывы отдельных цепей, взаимодействия между цепями ДНК или внутри них, реакции с растворителями или сшивки с белками. Рабочий процесс для этого метода имеет дополнительный шаг: после обработки как защищенной, так и незащищенной ДНК происходит последующее удлинение праймера расщепленных продуктов. [6] [7] Расширение прекратится при достижении поврежденного основания, и, таким образом, когда продукты ПЦР будут запущены бок о бок на геле; защищенный образец покажет дополнительную полосу, где ДНК была сшита со связанным белком. Преимущества использования УФ в том, что он реагирует очень быстро и, следовательно, может улавливать взаимодействия, которые являются только мгновенными. Кроме того, его можно применять in vivoэксперименты, потому что УФ может проникать через клеточные мембраны. Недостатком является то, что гель может быть трудно интерпретировать, так как связанный белок не защищает ДНК, он просто изменяет фотореакции поблизости. [8]
In vivo footprinting — это метод, используемый для анализа взаимодействий белок-ДНК, которые происходят в клетке в определенный момент времени. [9] [10] ДНКаза I может использоваться в качестве расщепляющего агента, если клеточная мембрана была пермеабилизована. Однако наиболее распространенным расщепляющим агентом является УФ-облучение, поскольку оно проникает через клеточную мембрану, не нарушая состояния клетки, и, таким образом, может улавливать взаимодействия, которые чувствительны к клеточным изменениям. После того, как ДНК была расщеплена или повреждена УФ-излучением, клетки можно лизировать, а ДНК очистить для анализа интересующей области. Лигирующая ПЦР — это альтернативный метод footprint in vivo . После того, как расщепляющий агент был использован на геномной ДНК, что привело к одноцепочечным разрывам, и ДНК была выделена, линкер добавляется к точкам разрыва. Интересующая область амплифицируется между линкером и геноспецифичным праймером, и при запуске на полиакриламидном геле будет иметь отпечаток, где был связан белок. [11] In vivo футпринтинг в сочетании с иммунопреципитацией можно использовать для оценки специфичности белка во многих местах по всему геному. ДНК, связанная с интересующим белком, может быть иммунопреципитирована с помощью антитела к этому белку, а затем можно оценить связывание специфической области с помощью техники футпринтинга ДНК. [12]
Метод ДНК-отпечатков может быть модифицирован для оценки прочности связывания белка с областью ДНК. Используя различные концентрации белка для эксперимента по отпечаткам, можно наблюдать появление отпечатка по мере увеличения концентрации, а затем оценить сродство связывания белков. [2]
Чтобы адаптировать технику футпринтинга к современным методам обнаружения, меченые фрагменты ДНК обнаруживаются с помощью капиллярного электрофореза вместо того, чтобы проходить через полиакриламидный гель. Если фрагмент ДНК, который нужно проанализировать, получен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), то легко связать флуоресцентную молекулу, такую как карбоксифлуоресцеин (FAM), с праймерами. Таким образом, фрагменты, полученные путем расщепления ДНКазой I, будут содержать FAM и будут обнаруживаться с помощью капиллярного электрофореза. Обычно к смеси фрагментов, которые нужно проанализировать, также добавляются стандарты размеров, меченые карбокситетраметилродамином (ROX). Таким образом, сайты связывания факторов транскрипции были успешно идентифицированы. [13]
Секвенирование следующего поколения позволило использовать подход на уровне генома для идентификации ДНК-отпечатков. Анализы открытого хроматина, такие как DNase-Seq [14] и FAIRE-Seq [15], доказали свою способность обеспечивать надежный регуляторный ландшафт для многих типов клеток. [16] Однако эти анализы требуют некоторых последующих биоинформатических анализов для предоставления ДНК-отпечатков на уровне генома. Предложенные вычислительные инструменты можно разделить на два класса: подходы, основанные на сегментации, и подходы, ориентированные на сайт.
Методы, основанные на сегментации, основаны на применении скрытых марковских моделей или методов скользящего окна для сегментации генома на открытые/закрытые области хроматина. Примерами таких методов являются: HINT, [17] метод Бойля [18] и метод Нефа. [19] Методы, ориентированные на сайты, с другой стороны, находят следы, учитывая открытый профиль хроматина вокруг сайтов связывания, предсказанных мотивом, т. е. регуляторных областей, предсказанных с использованием информации о последовательности ДНК-белка (закодированной в таких структурах, как матрица веса положения ). Примерами таких методов являются CENTIPEDE [20] и метод Куэльяра-Партиды. [21]