Подсчет клеток — это любой из различных методов подсчета или аналогичной количественной оценки клеток в биологических науках , включая медицинскую диагностику и лечение . Это важный подвид цитометрии , имеющий применение в исследованиях и клинической практике. Например, общий анализ крови может помочь врачу определить, почему пациент чувствует себя плохо и что делать, чтобы помочь. Количество клеток в жидких средах (таких как кровь , плазма , лимфа или лабораторный смыв) обычно выражается как количество клеток на единицу объема , таким образом выражая концентрацию (например, 5000 клеток на миллилитр).
Многочисленные процедуры в биологии и медицине требуют подсчета клеток. Подсчет клеток в известном малом объеме позволяет опосредовать концентрацию. Примеры необходимости подсчета клеток включают:
Существует несколько методов подсчета клеток. Некоторые из них примитивны и не требуют специального оборудования, поэтому могут быть реализованы в любой биологической лаборатории , в то время как другие полагаются на сложные электронные приборы.
Счетная камера — это предметное стекло микроскопа , специально разработанное для подсчета клеток. Гемоцитометры и счетные камеры Седжвика-Рафтера — это два типа счетных камер. Гемоцитометр имеет две сетчатые камеры в середине, которые при подсчете накрываются специальным стеклянным предметным стеклом. Капля клеточной культуры помещается в пространство между камерой и стеклянной крышкой, заполняя его посредством капиллярного действия . [1] Рассматривая образец под микроскопом , исследователь использует сетку, чтобы вручную подсчитать количество клеток в определенной области известного размера. Разделительное расстояние между камерой и крышкой заранее определено, таким образом, можно рассчитать объем подсчитанной культуры, а вместе с ним и концентрацию клеток. Жизнеспособность клеток также можно определить, если в жидкость добавить красители жизнеспособности.
Их преимущество в том, что они дешевы и быстры; это делает их предпочтительным методом подсчета в быстрых биологических экспериментах, где необходимо только определить, выросла ли клеточная культура, как ожидалось. Обычно исследуемую культуру необходимо разбавить, в противном случае высокая плотность клеток сделает подсчет невозможным. Необходимость разбавления является недостатком, поскольку каждое разбавление добавляет неточности к измерению. [2]
Чтобы количественно определить количество клеток в культуре, клетки можно просто высеять на чашку Петри с питательной средой . Если клетки эффективно распределены на чашке, можно предположить, что каждая клетка даст начало одной колонии или колониеобразующей единице (КОЕ) . Затем можно подсчитать колонии и на основе известного объема культуры, которая была распределена на чашке, можно рассчитать концентрацию клеток. Это часто выполняется в соответствии со стандартом ASTM D5465. [3]
Как и в случае со счетными камерами, культуры обычно необходимо сильно разбавить перед посевом; в противном случае вместо получения отдельных колоний, которые можно подсчитать, образуется так называемый «газон»: тысячи колоний, лежащих друг на друге. Кроме того, посев — самый медленный метод из всех: большинству микроорганизмов требуется не менее 12 часов, чтобы сформировать видимые колонии.
Хотя этот метод может быть трудоемким, он дает точную оценку количества жизнеспособных клеток (потому что только они смогут расти и образовывать видимые колонии). Поэтому он широко используется в экспериментах, направленных на количественную оценку количества клеток, устойчивых к лекарствам или другим внешним условиям (например, эксперимент Лурия-Дельбрюка или тест защиты от гентамицина ). Кроме того, подсчет колоний на агаровых пластинах может быть значительно облегчен с помощью счетчиков колоний .
Счетчик Культера — это прибор, который может подсчитывать клетки, а также измерять их объем. Он основан на том факте, что клетки проявляют большое электрическое сопротивление ; другими словами, они почти не проводят электричество . В счетчике Культера клетки, плавающие в растворе, проводящем электричество, всасываются одна за другой в крошечный зазор. По бокам зазора находятся два электрода , которые проводят электричество. Когда в зазоре нет ни одной клетки, электричество течет беспрепятственно, но когда клетка всасывается в зазор, ток сопротивляется. Счетчик Культера подсчитывает количество таких событий, а также измеряет ток ( и, следовательно, сопротивление), который напрямую коррелирует с объемом захваченной клетки. Похожая система — технология подсчета клеток CASY .
Счетчики Coulter и CASY намного дешевле проточных цитометров, и для приложений, требующих количества и размеров клеток, таких как исследование клеточного цикла , они являются методом выбора. Его преимущество перед методами выше заключается в большом количестве клеток, которые можно обработать за короткое время, а именно: тысячи клеток в секунду. Это обеспечивает большую точность и статистическую значимость .
Проточная цитометрия — это, безусловно, самый сложный и дорогой метод подсчета клеток. В проточном цитометре клетки движутся в узком потоке перед лазерным лучом. Луч попадает на них одну за другой, а светоприемник улавливает свет, отраженный от клеток.
Проточные цитометры обладают множеством других возможностей, таких как анализ формы клеток и их внутренней и внешней структуры, а также измерение количества специфических белков и других биохимических веществ в клетках. Поэтому проточные цитометры редко приобретаются исключительно для подсчета клеток. [ необходима цитата ]
В последних подходах рассматривается использование высококачественных микроскопических изображений, на которых применяется статистический алгоритм классификации для выполнения автоматического обнаружения и подсчета клеток в качестве задачи анализа изображения . [4] Обычно выполняется с постоянной частотой ошибок как автономный (пакетный) процесс. Для этой цели можно использовать ряд методов классификации изображений . [5]
В настоящее время стереологический подсчет клеток с ручным принятием решения о включении объектов в соответствии с беспристрастными правилами стереологического подсчета остается единственным адекватным методом для беспристрастной количественной оценки клеток в гистологических срезах тканей, поэтому он недостаточно адекватен для полной автоматизации. [6]
Суспензии клеток мутные . Клетки поглощают и рассеивают свет. Чем выше концентрация клеток, тем выше мутность. Спектрофотометры могут очень точно измерять интенсивность света. Культура клеток помещается в прозрачную кювету , и поглощение измеряется относительно только среды. Оптическая плотность (ОП) прямо пропорциональна биомассе в суспензии клеток в заданном диапазоне, который является специфическим для типа клеток. Использование спектрофотометрии для измерения мутности культур известно как турбидометрия .
Это сделало спектрофотометрию методом выбора для измерения роста бактерий и связанных с этим приложений. Недостатком спектрофотометрии является ее неспособность обеспечить абсолютный подсчет или различение живых и мертвых клеток.
Импедансная микробиология — это быстрый микробиологический метод , используемый для измерения концентрации микроорганизмов (в основном бактерий, но также и дрожжей ) в образце путем мониторинга электрических параметров питательной среды. Он основан на том факте, что метаболизм бактерий преобразует незаряженные (или слабо заряженные) соединения в высокозаряженные соединения, тем самым изменяя электрические свойства питательной среды . Концентрация микроорганизмов оценивается по времени, необходимому для отклонения контролируемых электрических параметров от исходного базового значения.
Существуют различные приборы (созданныe в лаборатории или имеющиеся в продаже) для измерения концентрации бактерий с использованием импедансной микробиологии. [7] [8] [9] [10] [11]