Протеинфосфатаза — это фермент фосфатазы , который удаляет фосфатную группу из фосфорилированного аминокислотного остатка своего субстратного белка. Фосфорилирование белка является одной из наиболее распространенных форм обратимой посттрансляционной модификации белка ( PTM ), при этом до 30% всех белков фосфорилируются в любой момент времени. Протеинкиназы (PK) являются эффекторами фосфорилирования и катализируют перенос γ-фосфата от АТФ к определенным аминокислотам в белках. Несколько сотен PK существуют у млекопитающих и классифицируются в отдельные суперсемейства. Белки фосфорилируются преимущественно по остаткам Ser, Thr и Tyr, которые составляют 79,3, 16,9 и 3,8% соответственно фосфопротеома, по крайней мере, у млекопитающих. Напротив, протеинфосфатазы (PP) являются основными эффекторами дефосфорилирования и могут быть сгруппированы в три основных класса на основе последовательности, структуры и каталитической функции. Самый большой класс PPs — это семейство фосфопротеинфосфатаз (PPP), включающее PP1, PP2A, PP2B, PP4, PP5, PP6 и PP7, и семейство протеинфосфатаз Mg 2+ - или Mn 2+ -зависимых (PPM), состоящее в основном из PP2C. Суперсемейство протеин-тирофосфатаз (PTP) образует вторую группу [1] , а протеинфосфатазы на основе аспартата — третью. Протеиновые псевдофосфатазы образуют часть более крупного семейства фосфатаз и в большинстве случаев считаются каталитически инертными, вместо этого функционируя как фосфатсвязывающие белки, интеграторы сигнализации или субклеточные ловушки. Известны примеры трансмембранных протеинфосфатаз, содержащих как активные (фосфатаза), так и неактивные (псевдофосфатаза) домены, связанные в тандеме, [1] концептуально схожие со структурой полипептида киназы и псевдокиназы псевдокиназ JAK. [2] [3] Полный сравнительный анализ человеческих фосфатаз и псевдофосфатаз был завершен Мэннингом и коллегами, [4] что является дополнением к новаторскому анализу человеческого кинома, который кодирует полный набор из ~536 человеческих протеинкиназ . [5]
Фосфорилирование включает перенос фосфатных групп от АТФ к ферменту, энергия для которого поступает из гидролиза АТФ в АДФ или АМФ . Однако дефосфорилирование высвобождает фосфаты в раствор в виде свободных ионов, поскольку присоединение их обратно к АТФ потребовало бы затрат энергии.
Цистеинзависимые фосфатазы (ЦДФ) катализируют гидролиз фосфоэфирной связи через промежуточное соединение фосфоцистеин. [6]
Свободный цистеиновый нуклеофил образует связь с атомом фосфора фосфатной части, а связь PO, соединяющая фосфатную группу с тирозином, протонируется либо соответствующим образом расположенным кислым аминокислотным остатком (Asp на схеме ниже), либо молекулой воды. Затем промежуточный фосфоцистеин гидролизуется другой молекулой воды, тем самым восстанавливая активный сайт для другой реакции дефосфорилирования.
Металлофосфатазы (например, PP2C) координируют 2 каталитически важных иона металла в своем активном центре. В настоящее время существует некоторая путаница в идентификации этих ионов металла, поскольку последовательные попытки идентифицировать их дают разные ответы. В настоящее время имеются доказательства того, что этими металлами могут быть магний , марганец , железо , цинк или любая их комбинация. Считается, что гидроксильный ион, соединяющий два иона металла, принимает участие в нуклеофильной атаке на ион фосфора .
Фосфатазы можно подразделить на основе их субстратной специфичности.
Белковые фосфатазы Ser/Thr были первоначально классифицированы с использованием биохимических анализов как тип 1 (PP1) или тип 2 (PP2) и далее подразделялись на основе потребности в ионах металла (PP2A, без ионов металла; PP2B, стимулируемая Ca 2+ ; PP2C, зависящая от Mg 2+ ) (Moorhead et al., 2007). Белковые фосфатазы Ser/Thr PP1, PP2A и PP2B семейства PPP вместе с PP2C семейства PPM отвечают за большую часть активности Ser/Thr PP in vivo (Barford et al., 1998). В мозге они присутствуют в различных субклеточных компартментах нейрональных и глиальных клеток и способствуют различным нейронным функциям.
Семейство PPM, включающее PP2C и фосфатазу пируватдегидрогеназы, представляет собой ферменты с ионами металлов Mn2 + /Mg2 + , устойчивые к классическим ингибиторам и токсинам семейства PPP. В отличие от большинства PPP, PP2C существует только в одной субъединице, но, как и PTP, он демонстрирует широкий спектр структурных доменов, которые придают уникальные функции. Кроме того, PP2C, по-видимому, не связан эволюционно с основным семейством Ser/Thr PP и не имеет гомологии последовательностей с древними ферментами PPP. Текущее предположение заключается в том, что PPM эволюционировали отдельно от PPP, но конвергировали в ходе эволюционного развития.
PTP класса I составляют самое большое семейство. Они содержат хорошо известные классические рецепторные (a) и нерецепторные PTP (b), которые строго специфичны к тирозину, и DSP (c), которые нацелены как на Ser/Thr, так и на Tyr и являются наиболее разнообразными с точки зрения субстратной специфичности.
Третий класс PTP содержит три регулятора клеточного цикла, CDC25A, CDC25B и CDC25C, которые дефосфорилируют CDK на их N-конце, реакция, необходимая для управления прогрессией клеточного цикла. Они сами регулируются фосфорилированием и деградируют в ответ на повреждение ДНК, чтобы предотвратить хромосомные аномалии.
Суперсемейство галоиддегалогеназ (HAD) — это еще одна группа PP, которая использует Asp в качестве нуклеофила и, как недавно было показано, имеет двойную специфичность. Эти PP могут быть нацелены как на Ser, так и на Tyr, но, как полагают, имеют большую специфичность к Tyr. Подсемейство HAD, семейство Eyes Absent (Eya), также являются факторами транскрипции и, следовательно, могут регулировать собственное фосфорилирование и фосфорилирование транскрипционных кофакторов, а также вносить вклад в контроль транскрипции генов. Сочетание этих двух функций в Eya показывает большую сложность контроля транскрипционных генов, чем считалось ранее. Еще одним членом этого класса является фосфатаза C-концевого домена РНК-полимеразы II. Хотя это семейство остается плохо изученным, известно, что оно играет важную роль в развитии и ядерной морфологии.
Многие фосфатазы беспорядочны в отношении типа субстрата или могут быстро эволюционировать, чтобы сменить субстрат. Альтернативная структурная классификация [4] отмечает, что 20 отдельных белковых складок обладают фосфатазной активностью, и 10 из них содержат протеинфосфатазы.
Фосфатазы действуют в противовес киназам / фосфорилазам , которые добавляют фосфатные группы к белкам. Добавление фосфатной группы может активировать или дезактивировать фермент (например, сигнальные пути киназы [11] ) или обеспечить взаимодействие белок-белок (например, домены SH2 [12] ); поэтому фосфатазы являются неотъемлемой частью многих путей передачи сигнала . Добавление и удаление фосфата не обязательно соответствуют активации или ингибированию фермента, и что несколько ферментов имеют отдельные сайты фосфорилирования для активации или ингибирования функциональной регуляции. CDK , например, может быть либо активирована, либо дезактивирована в зависимости от конкретного остатка аминокислоты, который фосфорилируется. Фосфаты важны для передачи сигнала , поскольку они регулируют белки, к которым они прикреплены. Чтобы обратить регуляторный эффект, фосфат удаляется. Это происходит само по себе путем гидролиза или опосредовано протеинфосфатазами. [13] [14]
Фосфорилирование белков играет решающую роль в биологических функциях и контролирует почти каждый клеточный процесс, включая метаболизм, транскрипцию и трансляцию генов, прогрессию клеточного цикла, перестройку цитоскелета, белок-белковые взаимодействия, стабильность белков, движение клеток и апоптоз . Эти процессы зависят от высокорегулируемых и противоположных действий PK и PP через изменения в фосфорилировании ключевых белков. Фосфорилирование гистонов, наряду с метилированием, убиквитинированием, сумоилированием и ацетилированием, также регулирует доступ к ДНК через реорганизацию хроматина. [15]
Одним из основных переключателей нейронной активности является активация PK и PP повышенным внутриклеточным кальцием. Степень активации различных изоформ PK и PP контролируется их индивидуальной чувствительностью к кальцию. Кроме того, широкий спектр специфических ингибиторов и партнеров по нацеливанию, таких как белки-скаффолдеры, якорные и адаптерные белки, также способствуют контролю PK и PP и рекрутируют их в сигнальные комплексы в нейрональных клетках. Такие сигнальные комплексы обычно действуют, чтобы привести PK и PP в тесную близость с целевыми субстратами и сигнальными молекулами, а также повысить их селективность, ограничивая доступ к этим субстратным белкам. Таким образом, события фосфорилирования контролируются не только сбалансированной активностью PK и PP, но и их ограниченной локализацией. Регуляторные субъединицы и домены служат для ограничения определенных белков определенными субклеточными компартментами и для модуляции специфичности белка. Эти регуляторы необходимы для поддержания скоординированного действия каскадов сигнализации, которые в нейрональных клетках включают краткосрочную (синаптическую) и долгосрочную (ядерную) сигнализацию. Эти функции частично контролируются аллостерической модификацией вторичными мессенджерами и обратимым фосфорилированием белков. [16] [17]
Считается, что около 30% известных ПП присутствуют во всех тканях, а остальные демонстрируют определенный уровень тканевых ограничений. В то время как фосфорилирование белков является общеклеточным регуляторным механизмом, недавние количественные протеомные исследования показали, что фосфорилирование преимущественно нацелено на ядерные белки. Многие ПП, которые регулируют ядерные события, часто обогащены или присутствуют исключительно в ядре. В нейрональных клетках ПП присутствуют в нескольких клеточных отсеках и играют важную роль как в пре-, так и в постсинапсах, в цитоплазме и в ядре, где они регулируют экспрессию генов. [18]
Фосфопротеинфосфатаза активируется гормоном инсулином , что указывает на высокую концентрацию глюкозы в крови . Затем фермент дефосфорилирует другие ферменты, такие как киназа фосфорилазы , гликогенфосфорилаза и гликогенсинтаза . Это приводит к тому, что киназа фосфорилазы и гликогенфосфорилаза становятся неактивными, в то время как гликогенсинтаза активируется. В результате синтез гликогена увеличивается, а гликогенолиз уменьшается, и чистый эффект заключается в том, что энергия поступает и хранится внутри клетки. [19]
В мозге взрослого человека PPs необходимы для синаптических функций и участвуют в отрицательной регуляции функций мозга более высокого порядка, таких как обучение и память. Нарушение регуляции их активности связано с несколькими расстройствами, включая когнитивное старение и нейродегенерацию, а также рак, диабет и ожирение. [20]
Гены человека, кодирующие белки с активностью фосфопротеинфосфатазы, включают:
