Блот в молекулярной биологии и генетике — метод переноса белков , ДНК или РНК на носитель (например, нитроцеллюлозную, поливинилиденфторидную или нейлоновую мембрану ) . Во многих случаях это делается после гель-электрофореза , перенося молекулы из геля на блоттинг-мембрану , а в других случаях добавляя образцы непосредственно на мембрану. После блоттинга перенесенные белки, ДНК или РНК затем визуализируются с помощью окрашивания красителем (например, окрашивания белков серебром), авторадиографической визуализации меченных радиоактивным изотопом молекул (выполняется перед блотингом) или специфического мечения некоторых белков или нуклеиновых кислот . Последнее делается с помощью антител или гибридизационных зондов , которые связываются только с некоторыми молекулами блота и к которым присоединен фермент . После правильной промывки эта ферментативная активность (и, следовательно, молекулы, которые мы ищем в блоте) визуализируется путем инкубации с соответствующим реактивом, вызывая либо цветной осадок на блоте, либо хемилюминесцентную реакцию , которая регистрируется фотопленкой .
Саузерн -блоттинг — это метод, обычно используемый в молекулярной биологии для обнаружения определенной последовательности ДНК в образцах ДНК. Саузерн-блоттинг сочетает в себе перенос фрагментов ДНК, разделенных электрофорезом, на мембрану фильтра и последующее обнаружение фрагментов путем гибридизации зонда. [1]
Вестерн -блоттинг используется для обнаружения специфических белков в сложных образцах. Белки сначала разделяют по размеру с помощью электрофореза, а затем переносят на соответствующую матрицу для блоттинга (обычно поливинилиденфторид или нитроцеллюлозу ) и последующего обнаружения с помощью антител.
Подобно вестерн-блоттингу , дальневестерн-блоттинг использует белок-белковые взаимодействия для обнаружения присутствия конкретного белка, иммобилизованного на матрице для блоттинга. Затем антитела используются для обнаружения присутствия белок-белкового комплекса, что делает дальневосточный блот специфическим случаем вестерн-блоттинга.
Юго -вестерн-блоттинг основан на Саузерн-блоттинге и используется для идентификации и характеристики ДНК-связывающих белков по их способности связываться со специфическими олигонуклеотидными зондами. [2] Белки разделяются с помощью гель-электрофореза и впоследствии переносятся на нитроцеллюлозные мембраны аналогично другим типам блоттинга.
Истерн -блоттинг используется для обнаружения специфических посттрансляционных модификаций белков. Белки разделяют с помощью гель-электрофореза перед переносом на блоттинг-матрицу, после чего посттрансляционные модификации выявляются с помощью специфических субстратов (холерного токсина, конканавалина, фосфомолибдата и т. д.) или антител. [3]
Дальневосточный блоттинг предназначен для обнаружения липидосвязанных олигосахаридов . Высокоэффективная тонкослойная хроматография сначала используется для разделения липидов по физическим и химическим характеристикам, затем переносится на матрицу для блоттинга, прежде чем олигосахариды будут обнаружены специфическим связывающим белком (т.е. антителами или лектинами).
Нозерн -блоттинг предназначен для обнаружения специфических последовательностей РНК в сложных образцах. Нозерн-блоттинг сначала разделяет образцы по размеру с помощью гель-электрофореза, а затем их переносят в матрицу для блоттинга и обнаруживают с помощью меченых зондов РНК.
Обратный нозерн-блот отличается как от нозерна, так и от Саузерн-блоттинга тем, что ДНК сначала иммобилизуют на матрице для блоттинга, а специфические последовательности выявляют с помощью меченых зондов РНК.
Дот -блоттинг представляет собой особый случай любого из вышеперечисленных блотов, когда аналит добавляется непосредственно в матрицу для блоттинга (и выглядит как «точка»), а не разделяет образец электрофорезом перед блоттингом.