Рамановский микроскоп — это лазерное микроскопическое устройство, используемое для проведения рамановской спектроскопии . [1] Термин MOLE (лазерный исследователь молекулярной оптики) используется для обозначения микрозонда на основе комбинационного рассеяния света. [1] Используемая методика названа в честь К.В. Рамана , открывшего рассеивающие свойства в жидкостях. [2]
При прямой визуализации все поле зрения исследуется на предмет рассеяния в небольшом диапазоне волновых чисел (комбинационное смещение). Например, волновое число, характерное для холестерина, можно использовать для регистрации распределения холестерина в клеточной культуре. Другой подход — это гиперспектральная визуализация или химическая визуализация , при которой получаются тысячи спектров комбинационного рассеяния света со всего поля зрения. Затем данные можно использовать для создания изображений, показывающих расположение и количество различных компонентов. На примере клеточной культуры гиперспектральное изображение может показать распределение холестерина [3] , а также белков, нуклеиновых кислот и жирных кислот. [4] [5] [6] Сложные методы обработки сигналов и изображений можно использовать, чтобы игнорировать присутствие воды, питательных сред, буферов и других помех.
Разрешение
Рамановская микроскопия и, в частности, конфокальная микроскопия , могут достигать субмикронного латерального пространственного разрешения. [7] Поскольку рамановский микроскоп представляет собой систему с дифракционными ограничениями , его пространственное разрешение зависит от длины волны света и числовой апертуры фокусирующего элемента. В конфокальной рамановской микроскопии дополнительным фактором является диаметр конфокальной апертуры. Как правило, поперечное пространственное разрешение может достигать примерно длины волны лазера при использовании воздушных объективов, тогда как объективы с масляной или водной иммерсией могут обеспечивать поперечное разрешение примерно в половину длины волны лазера. Это означает, что при работе в диапазоне от видимого до ближнего инфракрасного рамановский микроскоп может достигать поперечного разрешения прибл. от 1 мкм до 250 нм, в то время как разрешение по глубине (если не ограничено глубиной оптического проникновения образца) может варьироваться от 1–6 мкм с наименьшей конфокальной апертурой-обскурой до десятков микрометров при работе без конфокальной обскуры. [8] [9] [10] Поскольку объективы микроскопов фокусируют лазерный луч до микрометрового диапазона, результирующий поток фотонов намного выше, чем достигается в обычных рамановских установках. Это имеет дополнительный эффект увеличения фотообесцвечивания молекул, излучающих мешающую флуоресценцию. Однако высокий поток фотонов также может вызвать деградацию образца, поэтому для каждого типа образца необходимо тщательно выбирать длину волны лазера и мощность лазера.
Рамановская визуализация
Химическое изображение фармацевтической эмульсии, полученное с помощью конфокальной рамановской микроскопии (микроскоп Alpha300, WITec; синий: активный фармацевтический ингредиент, зеленый: масло, красный: примеси кремния).
Еще один инструмент, который становится все более популярным, — это глобальная рамановская визуализация. Этот метод используется для характеристики крупномасштабных устройств, картирования различных соединений и изучения динамики. Он уже использовался для характеристики слоев графена , [11] J-агрегированных красителей внутри углеродных нанотрубок и множества других двумерных материалов, таких как MoS 2 [12] и WSe 2 . Поскольку луч возбуждения рассредоточен по всему полю зрения, эти измерения можно проводить, не повреждая образец. С помощью рамановской микроспектроскопии можно измерить in vivo рамановские спектры микроскопических областей образцов с временным и пространственным разрешением. В результате можно устранить флуоресценцию воды, сред и буферов. Следовательно, он подходит для исследования белков, клеток и органелл.
В рамановской микроскопии биологических и медицинских образцов обычно используются лазеры ближнего инфракрасного диапазона (NIR) ( особенно распространены диоды 785 нм и Nd:YAG 1064 нм ). Это снижает риск повреждения образца из-за применения волн с более высокой энергией. Однако интенсивность комбинационного рассеяния света в ближнем ИК-диапазоне низкая (из-за зависимости интенсивности комбинационного рассеяния света от ω 4 ), и большинству детекторов требуется очень длительное время сбора данных. В последнее время стали доступны более чувствительные детекторы, что сделало этот метод более подходящим для общего использования. Рамановская микроскопия неорганических образцов, таких как камни, керамика и полимеры, [13] может использовать более широкий диапазон длин волн возбуждения.
Корреляционная рамановская электронная электронная микроскопия гематита (сделанная с помощью микроскопа RISE, WITec). Рамановское изображение накладывается на изображение СЭМ.
Конфокальную рамановскую микроскопию можно комбинировать со многими другими методами микроскопии. Используя различные методы и сопоставляя данные, пользователь достигает более полного понимания образца. Распространенными примерами методов корреляционной микроскопии являются Raman-AFM , [16] [13], Raman- SNOM , [17] и Raman- SEM . [18]
Корреляционная СЭМ-рамановская визуализация — это интеграция конфокального рамановского микроскопа в камеру СЭМ, которая позволяет коррелировать изображения нескольких методов, таких как SE, BSE, EDX , EBSD , EBIC , CL , AFM . [19] Образец помещается в вакуумную камеру электронного микроскопа. Оба метода анализа затем выполняются автоматически в одном и том же месте пробы. Полученные изображения SEM и комбинационного рассеяния света затем можно наложить друг на друга. [20] [21] Кроме того, добавление сфокусированного ионного луча (FIB) в камеру позволяет удалить материал и, следовательно, получить трехмерное изображение образца. Режим низкого вакуума позволяет проводить анализ биологических и непроводящих образцов.
Биологические применения
С помощью рамановской микроспектроскопии можно измерить in vivo рамановские спектры микроскопических областей образцов с временным и пространственным разрешением. Отбор проб является неразрушающим, и вода, среда и буферы обычно не мешают анализу. Следовательно, рамановская спектроскопия с временным и пространственным разрешением in vivo подходит для исследования белков , клеток и органов . В области микробиологии конфокальная рамановская микроспектроскопия использовалась для картирования внутриклеточного распределения макромолекул, таких как белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты и полимерные включения, такие как поли-β-гидроксимасляная кислота и полифосфаты в бактериях и стерины в микроводорослях. Сочетание экспериментов по зондированию стабильных изотопов (SIP) с конфокальной рамановской микроспектроскопией позволило определить скорость ассимиляции 13 C и 15 N-субстратов, а также D 2 O отдельными бактериальными клетками. [22]
^ ab Микроскопические методы с использованием рамановского микрозонда лазерного детектора молекулярной оптики , М. Е. Андерсен, Р. З. Мугли, Аналитическая химия, 1981, 53 (12), стр. 1772–1777 [1]
^ Подтверждающая информация Т. Шмида; Н. Шефер; С. Левченко; Т. Риссом; Д. Абу-Рас (2015). «Ориентационно-распределительное картирование поликристаллических материалов методом рамановской микроспектроскопии». Научные отчеты . 5 : 18410. Бибкод : 2015NatSR...518410S. дои : 10.1038/srep18410. ISSN 2045-2322. ПМК 4682063 . ПМИД 26673970.
^ Лотар Опилик; Томас Шмид; Ренато Зеноби (2013). «Современная рамановская визуализация: колебательная спектроскопия в масштабах микрометра и нанометра». Ежегодный обзор аналитической химии . 6 : 379–398. Бибкод : 2013ARAC....6..379O. doi : 10.1146/annurev-anchem-062012-092646. ISSN 1936-1335. ПМИД 23772660.
^ Шен, Цзэсян; Ю, Тинг; Ван, Инъин; Ни, Чжэньхуа (01 октября 2008 г.). «Раман-спектроскопия и визуализация графена». Нано-исследования . 1 (4): 273–291. arXiv : 0810.2836 . doi : 10.1007/s12274-008-8036-1. ISSN 1998-0000. S2CID 33529560.
^ Ли, Хай; Лу, Банда; Инь, Цзунъю; Он, Циюань; Ли, Хун; Чжан, Цин; Чжан, Хуа (12 марта 2012 г.). «Оптическая идентификация одно- и малослойных листов MoS2». Маленький . 8 (5): 682–686. дои : 10.1002/smll.201101958. ISSN 1613-6829. ПМИД 22223545.
^ Аб Шмидт, Ю.; Хильд, С.; Ибах, В.; Холричер, О. (1 декабря 2005 г.). «Характеристика тонких полимерных пленок в нанометровом масштабе с помощью конфокальной рамановской АСМ». Макромолекулярные симпозиумы . 230 (1): 133–143. дои : 10.1002/masy.200551152. ISSN 1521-3900.
^ Он, Чжэ; Хан, Зехуа; Кайзер, Меган; Линхардт, Роберт Дж.; Ван, Син; Синюков Александр Михайлович; Ван, Цзичжоу; Декерт, Волкер; Соколов, Алексей В. (16 января 2019 г.). «Расширенное комбинационное сканирование одноцепочечной ДНК с разрешением по одному основанию». Журнал Американского химического общества . 141 (2): 753–757. дои : 10.1021/jacs.8b11506. ISSN 0002-7863. PMID 30586988. S2CID 58552541.
^ Пиларчик, Марта; Рыгула, Анна; Качор, Агнешка; Матеушук, Лукаш; Маслак, Эдита; Хлопицкий, Стефан; Баранска, Малгожата (01 ноября 2014 г.). «Новый подход к исследованию сосудистой стенки в 3D: комбинированная рамановская спектроскопия и атомно-силовая микроскопия для визуализации аорты на лице». Колебательная спектроскопия . 75 : 39–44. doi :10.1016/j.vibspec.2014.09.004. ISSN 0924-2031.
^ Старк, Роберт В.; Хилленбранд, Райнер; Зиглер, Александр; Бауэр, Майкл; Хубер, Андреас Дж.; Гиглер, Александр М. (07 декабря 2009 г.). «Наномасштабное картирование поля остаточных напряжений вокруг наноотпечатков в SiC с помощью ИК s-SNOM и конфокальной рамановской микроскопии». Оптика Экспресс . 17 (25): 22351–22357. Бибкод : 2009OExpr..1722351G. дои : 10.1364/OE.17.022351 . ISSN 1094-4087. ПМИД 20052158.
^ Карделл, Каролина; Герра, Изабель (01 марта 2016 г.). «Обзор новых систем SEM-EDX и рамановской спектроскопии, разделенных через дефис: применение в науках о жизни, окружающей среде и материалах». TrAC Тенденции в аналитической химии . 77 : 156–166. дои : 10.1016/j.trac.2015.12.001. ISSN 0165-9936.
^ Йируше, Ярослав; Ханичинец, Мартин; Гавелка, Милослав; Холлрихер, Олаф; Ибах, Вольфрам; Спизиг, Питер (2014). «Интеграция сканирующего электронного микроскопа с фокусированным ионным пучком и конфокального рамановского микроскопа в единый прибор». Журнал вакуумной науки и технологий B, Нанотехнологии и микроэлектроника: материалы, обработка, измерения и явления . 32 (6): 06FC03. дои : 10.1116/1.4897502.
