Мутация сдвига рамки считывания (также называемая ошибкой кадрирования или сдвигом рамки считывания ) — это генетическая мутация , вызванная вставками ( инсерциями или делециями ) ряда нуклеотидов в последовательности ДНК, которая не делится на три. Из-за триплетного характера экспрессии гена кодонами вставка или удаление может изменить рамку считывания ( группировку кодонов), что приведет к совершенно отличной от оригинала трансляции . Чем раньше в последовательности происходит делеция или вставка, тем более изменен белок. [1] Мутация сдвига рамки считывания — это не то же самое, что однонуклеотидный полиморфизм , при котором нуклеотид заменяется, а не вставляется или удаляется. Мутация сдвига рамки считывания обычно приводит к считыванию кодонов после мутации, кодирующих разные аминокислоты. Мутация сдвига рамки также изменит первый стоп-кодон («UAA», «UGA» или «UAG»), встречающийся в последовательности. Создаваемый полипептид может быть аномально коротким или аномально длинным и, скорее всего, не будет функциональным. [2]
Мутации сдвига рамки считывания очевидны при тяжелых генетических заболеваниях, таких как болезнь Тея-Сакса ; они повышают восприимчивость к некоторым видам рака и классам семейной гиперхолестеринемии ; в 1997 году [3] мутация сдвига рамки считывания была связана с устойчивостью к инфекции ретровирусом ВИЧ. Мутации сдвига рамки считывания были предложены в качестве источника биологической новизны, как и в случае с предполагаемым созданием нейлоназы , однако эта интерпретация противоречива. Исследование Negoro et al (2006) [4] показало, что мутация сдвига рамки считывания вряд ли была причиной и что скорее замена двух аминокислот в активном сайте предковой эстеразы приводила к образованию нейлоназы.
Информация, содержащаяся в ДНК, определяет функцию белка в клетках всех организмов. Транскрипция и трансляция позволяют передавать эту информацию при создании белков. Однако ошибка в чтении этого сообщения может привести к неправильной функции белка и в конечном итоге вызвать заболевание, даже если клетка принимает различные корректирующие меры. Генетическая информация передается ДНК для синтеза белка внутри клеток. Неправильная интерпретация может привести к нарушению функции и заболеванию, несмотря на механизмы клеточной коррекции.
В 1956 году Фрэнсис Крик описал поток генетической информации от ДНК к определенному расположению аминокислот для создания белка как центральную догму. [1] Для правильного функционирования клетки необходимо, чтобы белки вырабатывались точно для структурной и каталитической активности. Неправильно созданный белок может оказать пагубное воздействие на жизнеспособность клеток и в большинстве случаев привести к тому, что высший организм станет нездоровым из-за аномальных клеточных функций. Чтобы гарантировать, что геном успешно передает информацию, в репликацию ДНК включаются механизмы корректуры , такие как экзонуклеазы и системы репарации несоответствий . [1]
После репликации ДНК считывание выбранного участка генетической информации осуществляется путем транскрипции . [1] Нуклеотиды, содержащие генетическую информацию, теперь находятся на одноцепочечной информационной матрице, называемой мРНК . мРНК включается в субъединицу рибосомы и взаимодействует с рРНК . Генетическая информация, несущаяся в кодонах мРНК, теперь считывается (декодируется) антикодонами тРНК. По мере считывания каждого кодона (триплета) аминокислоты соединяются вместе до тех пор, пока не будет достигнут стоп-кодон (UAG, UGA или UAA). В этот момент полипептид (белок) синтезируется и высвобождается. [1] На каждые 1000 аминокислот, включенных в белок, не более одной неправильной. Такая точность распознавания кодонов, сохраняющая важность правильной рамки считывания, достигается за счет правильного спаривания оснований в сайте рибосомы А, GTP- гидролизной активности EF-Tu (форма кинетической стабильности) и механизма корректуры при высвобождении EF-Tu. . [1]
Сдвиг рамки считывания также может происходить во время профазной трансляции, приводя к образованию различных белков из перекрывающихся открытых рамок считывания, таких как ретровирусные белки gag-pol-env. Это довольно часто встречается у вирусов , а также у бактерий и дрожжей (Farabaugh, 1996). Обратная транскриптаза , в отличие от РНК-полимеразы II , считается более сильной причиной возникновения мутаций сдвига рамки считывания. В экспериментах только 3–13% всех мутаций сдвига рамки возникали из-за РНК-полимеразы II. У прокариот частота ошибок, вызывающих мутации сдвига рамки считывания, находится лишь где-то в диапазоне 0,0001 и 0,00001. [5]
Существует несколько биологических процессов, которые помогают предотвратить мутации сдвига рамки считывания. Возникают обратные мутации, которые изменяют мутированную последовательность обратно на исходную последовательность дикого типа . Другой возможностью коррекции мутации является использование мутации-супрессора . Это компенсирует эффект исходной мутации, создавая вторичную мутацию, сдвигая последовательность, чтобы можно было прочитать правильные аминокислоты. Гид-РНК также можно использовать для вставки или удаления уридина в мРНК после транскрипции, это позволяет получить правильную рамку считывания. [1]
Кодон – это набор из трех нуклеотидов , триплет , кодирующий определенную аминокислоту . Первый кодон устанавливает рамку считывания, благодаря чему начинается новый кодон. Аминокислотная последовательность основной цепи белка определяется смежными тройками. [6] Кодоны играют ключевую роль в трансляции генетической информации для синтеза белков. Рамка считывания устанавливается в момент начала трансляции мРНК и поддерживается при чтении одного триплета в другой. Чтение генетического кода подчиняется трем правилам контроля кодонов в мРНК. Во-первых, кодоны читаются в направлении от 5’ к 3’. Во-вторых, кодоны не перекрываются и в сообщении нет пробелов. Последнее правило, как сказано выше, заключается в том, что сообщение транслируется в фиксированной рамке чтения. [1]
Мутации сдвига рамки считывания могут возникать случайно или быть вызваны внешним стимулом. Обнаружение мутаций сдвига рамки считывания может происходить несколькими различными методами. Сдвиг рамки считывания — это лишь один из типов мутаций, которые могут привести к образованию неполных или неправильных белков, но на их долю приходится значительный процент ошибок в ДНК. В неизмененном гене кодоны (тройки нуклеотидов) интерпретируются последовательно, причем каждый кодон кодирует определенную аминокислоту. кислота. Это известно как стандартная рамка считывания. Однако в случае мутаций сдвига рамки считывания в последовательность ДНК вставляется дополнительный нуклеотид (или несколько), нарушая типичную рамку считывания и вызывая сдвиг последовательности.
Эта вставка вызывает сдвиг рамки считывания из-за триплетной природы генетического кода. Например, добавление дополнительной буквы «А» приводит к сдвигу последовательности, вызывая считывание совершенно другого набора кодонов. Это отклонение в генетической информации приводит к тому, что рибосома, которая считывает мРНК для синтеза белка, неправильно интерпретирует генетические данные. Следовательно, генерируется совершенно другой ряд аминокислот, что приводит к образованию измененной последовательности белка. В большинстве случаев новая рамка считывания приводит к ранней встрече со стоп-кодоном, что приводит к образованию укороченного и обычно неактивного белка. Эту форму мутации называют ранним стоп-кодоном или нонсенс-мутацией.
Это генетическая мутация на уровне нуклеотидных оснований. Почему и как происходят мутации сдвига рамки считывания, постоянно ведется поиск. Было проведено экологическое исследование, в частности, производство мутаций сдвига рамки, индуцированных УФ- излучением, ДНК-полимеразами, дефицитными по экзонуклеазной активности 3' → 5'. Нормальная последовательность 5' GTC GTT TTA CAA 3' была заменена на GTC GTT T TTA CAA (MIDT) или GTC GTT C TTA CAA (MIDC) для изучения сдвигов рамки. Мутантные ферменты ДНК-полимеразы E. coli pol I Kf и T7 , лишенные экзонуклеазной активности 3' → 5', производят УФ-индуцированные ревертанты с более высокой частотой, чем их опытные аналоги по экзонуклеазе . Данные показывают, что потеря корректурной активности увеличивает частоту сдвигов кадров, вызванных УФ-излучением. [7]
Влияние соседних оснований и вторичной структуры на обнаружение частоты мутаций сдвига рамки было тщательно исследовано с использованием флуоресценции . Флуоресцентно-меченная ДНК с помощью аналогов оснований позволяет изучать локальные изменения последовательности ДНК. [8] Исследования влияния длины цепи праймера показывают, что равновесная смесь четырех конформаций гибридизации наблюдалась, когда основания матрицы образовывали петлю в виде выпуклости, то есть структуры, фланкированной с обеих сторон дуплексной ДНК. Напротив, двухпетлевая структура с необычной несложенной конформацией ДНК на ее нижнем крае наблюдалась, когда экструдированные основания располагались на стыке праймер-матрица, показывая, что несовпадения могут быть модифицированы соседней вторичной структурой ДНК. [9]
Секвенирование по Сэнгеру и пиросеквенирование — это два метода, которые использовались для обнаружения мутаций сдвига рамки считывания, однако вполне вероятно, что полученные данные будут не самого высокого качества. Тем не менее, с помощью секвенирования Сэнгера было идентифицировано 1,96 миллиона инделей , которые не пересекаются с другими базами данных. Когда наблюдается мутация сдвига рамки считывания, ее сравнивают с базой данных мутаций генома человека (HGMD), чтобы определить, оказывает ли мутация повреждающий эффект. Это делается путем рассмотрения четырех функций. Во-первых, соотношение между затронутой и консервативной ДНК, во-вторых, расположение мутации относительно транскрипта, в-третьих, соотношение консервативных и затронутых аминокислот и, наконец, расстояние от индели до конца экзона . [10]
Массивно-параллельное секвенирование — это новый метод, который можно использовать для обнаружения мутаций. Используя этот метод, можно секвенировать до 17 гигабаз одновременно, в отличие от ограниченного диапазона секвенирования по Сэнгеру , составляющего всего около 1 килобаз. Для проведения этого теста доступно несколько технологий, и рассматривается возможность его использования в клинических приложениях. [11] При тестировании на различные виды рака современные методы позволяют рассматривать только один ген за раз. Массивно-параллельное секвенирование позволяет одновременно выявить множество мутаций, вызывающих рак, в отличие от нескольких конкретных тестов. [12] Эксперимент по определению точности этого нового метода секвенирования был протестирован на 21 гене и не выявил ложноположительных сигналов о мутациях сдвига рамки считывания. [13]
В патенте США (5958684), выданном Леувеном в 1999 г., подробно описаны методы и реагенты для диагностики заболеваний, вызванных или связанных с геном, имеющим соматическую мутацию, вызывающую мутацию сдвига рамки считывания. Эти методы включают предоставление образца ткани или жидкости и проведение анализа генов на предмет мутации сдвига рамки считывания или белка, являющегося результатом мутации этого типа. Нуклеотидная последовательность подозреваемого гена получена из опубликованных последовательностей генов или в результате клонирования и секвенирования подозреваемого гена. Затем прогнозируется аминокислотная последовательность, кодируемая геном. [14] Секвенирование NA: секвенирование по Сэнгеру или секвенирование следующего поколения (NGS) можно использовать для прямого секвенирования ДНК и идентификации вставок или делеций. Полимеразная цепная реакция (ПЦР): ПЦР можно использовать для амплификации конкретной области, содержащей мутацию для последующий анализ. Мультиплексная амплификация зонда, зависимая от лигирования (MLPA): MLPA — это метод, используемый для обнаружения изменений количества копий и небольших вставок или делеций. Сравнительная геномная гибридизация (CGH): CGH используется для обнаружения хромосомного дисбаланса, который может включать большие вставки или делеции. удаления.
Несмотря на правила, которые управляют генетическим кодом и различными механизмами, присутствующими в клетке и обеспечивающими правильную передачу генетической информации в процессе репликации ДНК, а также во время трансляции, мутации все же происходят; Мутация сдвига рамки считывания — не единственный тип. Есть как минимум два других типа признанных точковых мутаций, а именно миссенс-мутация и нонсенс-мутация . [1] Мутация сдвига рамки может радикально изменить способность кодирования (генетическую информацию) сообщения. [1] Небольшие вставки или делеции (менее 20 пар оснований) составляют 24% мутаций, которые проявляются при признанных в настоящее время генетических заболеваниях. [10]
Обнаружено, что мутации сдвига рамки считывания чаще встречаются в повторяющихся областях ДНК. Причиной этого является проскальзывание фермента полимеразы в повторяющихся областях, что позволяет мутациям проникнуть в последовательность . [15] Можно провести эксперименты для определения частоты мутации сдвига рамки считывания путем добавления или удаления заранее установленного количества нуклеотидов. Были проведены эксперименты по добавлению четырех пар оснований, называемые экспериментами +4, но команда из Университета Эмори изучила разницу в частоте мутаций, добавляя и удаляя пару оснований. Было показано, что не было разницы в частоте добавления и удаления пары оснований. Однако существует разница в конечном результате белка. [15]
Болезнь Хантингтона является одним из девяти нарушений повторения кодонов, вызванных мутациями расширения полиглутамина, которые включают спинно-мозжечковую атаксию (SCA) 1, 2, 6, 7 и 3, спинобульбарную мышечную атрофию и дентаторубал-паллидолуизианотрофию. Между заболеваниями, вызванными полиглутамином, и мутациями расширения полиаланина может существовать связь, например, сдвиг рамки исходного продукта гена SCA3, кодирующего CAG/полиглутамины, на GCA/полиаланин. Рибосомальное проскальзывание во время трансляции белка SCA3 было предложено как механизм, приводящий к сдвигу от полиглутамина к рамке, кодирующей полиаланин. Делеция динуклеотида или вставка одного нуклеотида в полиглутаминовый тракт экзона 1 хантингтина сместят CAG, рамку, кодирующую полиглутаминин, на +1 (+1 сдвиг рамки) к GCA, рамке, кодирующей полиаланин, и введут новый эпитоп на С-конец Htt экзон 1 (APAAAAPAATRPCG). [16]
Некоторые заболевания имеют мутации сдвига рамки считывания как, по крайней мере, часть причины. Знание распространенных мутаций также может помочь в диагностике заболевания. В настоящее время предпринимаются попытки с пользой использовать мутации сдвига рамки считывания при лечении заболеваний, изменяя рамку считывания аминокислот.
Известно, что мутации сдвига рамки считывания являются фактором колоректального рака, а также других видов рака с микросателлитной нестабильностью . Как указывалось ранее, мутации сдвига рамки считывания с большей вероятностью возникают в области повторяющейся последовательности. Когда восстановление несоответствия ДНК не устраняет добавление или удаление оснований, эти мутации с большей вероятностью будут патогенными. Частично это может быть связано с тем, что опухоли не приказано прекратить рост. Эксперименты на дрожжах и бактериях помогают выявить характеристики микросателлитов, которые могут способствовать восстановлению дефектных несоответствий ДНК. К ним относятся длина микросателлита , состав генетического материала и чистота повторов. Согласно экспериментальным результатам, более длинные микросателлиты имеют более высокий уровень мутаций сдвига рамки считывания. Фланкирующая ДНК также может способствовать мутациям сдвига рамки считывания. [17] При раке простаты мутация сдвига рамки изменяет открытую рамку считывания (ORF) и предотвращает возникновение апоптоза . Это приводит к нерегулируемому росту опухоли . Хотя существуют факторы окружающей среды, которые способствуют прогрессированию рака простаты , существует также генетический компонент. В ходе тестирования кодирующих регионов на выявление мутаций было обнаружено 116 генетических вариантов, в том числе 61 мутация сдвига рамки считывания. [18] Существует более 500 мутаций в 17-й хромосоме, которые, по-видимому, играют роль в развитии рака молочной железы и яичников в гене BRCA1, многие из которых являются сдвигом рамки считывания. [19]
Болезнь Крона связана с геном NOD2. Мутация представляет собой вставку цитозина в положение 3020. Это приводит к преждевременному появлению стоп-кодона, укорачивая белок, который должен транскрибироваться. Когда белок способен нормально формироваться, он реагирует на бактериальные липосахариды, при этом мутация 3020insC предотвращает реакцию белка. [20]
Муковисцидоз (МВ) – заболевание, в основе которого лежат мутации гена регулятора трансмембранной проводимости МВ (CFTR). Выявлено более 1500 мутаций, но не все вызывают заболевание. [21] Большинство случаев муковисцидоза являются результатом мутации ∆F508, которая удаляет всю аминокислоту. Для диагностики CF представляют интерес две мутации сдвига рамки считывания: CF1213delT и CF1154-insTC. Обе эти мутации обычно происходят в тандеме по крайней мере с еще одной мутацией. Оба они приводят к небольшому снижению функции легких и встречаются примерно у 1% обследованных пациентов. Эти мутации были идентифицированы с помощью секвенирования по Сэнгеру. [22]
CCR5 является одним из кофакторов проникновения в клетку, связанных с ВИЧ, чаще всего связан со штаммами, не индуцирующими синцитий, и наиболее выражен у пациентов с ВИЧ, в отличие от пациентов со СПИДом. Делеция в 32 пары оснований в CCR5 была идентифицирована как мутация, которая сводит на нет вероятность ВИЧ-инфекции. Эта область открытой рамки считывания ORF содержит мутацию сдвига рамки считывания, приводящую к преждевременному стоп-кодону. Это приводит к потере функции ВИЧ-корецептора in vitro. CCR5-1 считается диким типом, а CCR5-2 считается мутантным аллелем. Те, у кого была гетерозиготная мутация CCR5, были менее восприимчивы к развитию ВИЧ. В исследовании, несмотря на высокий уровень воздействия вируса ВИЧ, не было ни одного человека, гомозиготного по мутации CCR5, который дал бы положительный результат на ВИЧ. [3]
Болезнь Тея-Сакса — смертельное заболевание, поражающее центральную нервную систему. Чаще всего встречается у младенцев и маленьких детей. Прогрессирование заболевания начинается еще в утробе матери , но симптомы не появляются примерно до 6-месячного возраста. Лекарства от этой болезни не существует. [23] Известно, что мутации в гене β-гексозаминидазы А (Hex A) влияют на возникновение синдрома Тея-Сакса, при этом описано 78 мутаций различных типов, 67 из которых, как известно, вызывают заболевание. Большинство наблюдаемых мутаций (65/78) представляют собой одноосновные замены или SNP, 11 делеций, 1 большую и 10 малых, а также 2 инсерции. 8 из наблюдаемых мутаций представляют собой сдвиг рамки считывания, 6 делеций и 2 инсерции. Вставка из 4 пар оснований в экзоне 11 наблюдается в 80% случаев болезни Тея-Сакса у еврейского населения ашкенази . Мутации сдвига рамки считывания приводят к появлению раннего стоп-кодона, который, как известно, играет роль в заболевании у младенцев. Заболевание с отсроченным началом, по-видимому, вызвано четырьмя различными мутациями, одна из которых представляет собой делецию трех пар оснований. [24]
Синдром Смита-Магениса (СМС) представляет собой сложный синдром, включающий интеллектуальные нарушения, нарушения сна, поведенческие проблемы и различные черепно-лицевые, скелетные и висцеральные аномалии. В большинстве случаев СМС имеется общая делеция размером ~3,5 Мб, которая включает ген индуцированного ретиноевой кислотой-1 ( RAI1 ). Другие случаи иллюстрируют вариабельность фенотипа SMS, ранее не выявленную для мутации RAI1, включая потерю слуха, отсутствие самооскорбительного поведения и умеренные глобальные задержки. Секвенирование RAI1 выявило мутацию гептамерного C-тракта (CCCCCCC) в экзоне 3, приводящую к мутациям сдвига рамки считывания. Из семи зарегистрированных мутаций сдвига рамки считывания, происходящих в поли-С-трактах в RAI1, четыре случая (~ 57%) происходят в этом гептамерном С-тракте. Результаты показывают, что этот гептамерный C-тракт является предпочтительной горячей точкой рекомбинации вставки/делеции (SNindels) и, следовательно, основной мишенью для анализа у пациентов с подозрением на мутации в RAI1. [25]
Гипертрофическая кардиомиопатия является наиболее частой причиной внезапной смерти у молодых людей, в том числе у тренированных спортсменов, и обусловлена мутациями генов, кодирующих белки сердечного саркомера. Мутации в гене тропонина С ( TNNC1 ) являются редкой генетической причиной гипертрофической кардиомиопатии. Недавнее исследование показало, что мутация сдвига рамки считывания (c.363dupG или p.Gln122AlafsX30) в тропонине С была причиной гипертрофической кардиомиопатии (и внезапной сердечной смерти) у 19-летнего мужчины. [26]
Найти лекарство от болезней, вызванных мутациями сдвига рамки считывания, удается редко. Исследования по этому поводу продолжаются. Одним из примеров является первичный иммунодефицит (ПИД), наследственное заболевание, которое может привести к увеличению числа инфекций. Существует 120 генов и 150 мутаций, которые играют роль в развитии первичных иммунодефицитов. Стандартным лечением в настоящее время является генная терапия , но это очень рискованное лечение и часто может привести к другим заболеваниям, таким как лейкемия. Процедуры генной терапии включают модификацию слитого белка нуклеазы цинкового фингера, расщепление обоих концов мутации, что, в свою очередь, удаляет ее из последовательности. Пропуск экзонов , опосредованный антисмысловыми олигонуклеотидами , является еще одной возможностью мышечной дистрофии Дюшенна . Этот процесс позволяет передать мутацию так, что остальная часть последовательности останется в рамке, а функция белка останется неизменной. Однако это не излечивает болезнь, а лишь лечит симптомы и применимо только к структурным белкам или другим повторяющимся генам. Третья форма репарации — ревертантный мозаицизм , который естественным образом возникает за счет создания обратной мутации или мутации во втором сайте, корректирующей рамку считывания. Эта реверсия может произойти в результате внутригенной рекомбинации , митотической конверсии гена, проскальзывания ДНК второго сайта или сайт-специфической реверсии. Это возможно при некоторых заболеваниях, таких как Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД), синдром Вискотта-Олдрича и синдром Блума . Не существует лекарств или других фармакогеномных методов, помогающих при ПИД. [27]
В европейском патенте (EP1369126A1), выданном Борком в 2003 году, описан метод, используемый для профилактики рака и лечения рака и предраковых заболеваний, таких как спорадические опухоли с дефицитом репарации несоответствия ДНК (MMR) и опухоли, связанные с HNPCC. Идея состоит в том, чтобы использовать иммунотерапию с использованием комбинаторных смесей опухолеспецифичных пептидов, полученных из мутаций сдвига рамки считывания, чтобы вызвать цитотоксический Т-клеточный ответ, специально направленный против опухолевых клеток. [28]