Техника пэтч-клампа — это лабораторная техника в электрофизиологии, используемая для изучения ионных токов в отдельных изолированных живых клетках , срезах тканей или участках клеточной мембраны. Техника особенно полезна при изучении возбудимых клеток, таких как нейроны , кардиомиоциты , мышечные волокна и бета-клетки поджелудочной железы , а также может применяться для изучения бактериальных ионных каналов в специально подготовленных гигантских сферопластах .
Зажим патча может быть выполнен с использованием техники фиксации напряжения . В этом случае напряжение на клеточной мембране контролируется экспериментатором, а результирующие токи регистрируются. В качестве альтернативы можно использовать технику фиксации тока . В этом случае ток, проходящий через мембрану, контролируется экспериментатором, а результирующие изменения напряжения регистрируются, как правило, в форме потенциалов действия .
Эрвин Неер и Берт Сакманн разработали метод патч-кламп в конце 1970-х и начале 1980-х годов. Это открытие позволило впервые зарегистрировать токи молекул одиночных ионных каналов, что улучшило понимание участия каналов в фундаментальных клеточных процессах, таких как потенциалы действия и нервная активность. Неер и Сакманн получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1991 году за эту работу. [1]
Во время записи методом пэтч-кламп полая стеклянная трубка, известная как микропипетка или пэтч-пипетка, заполненная раствором электролита, и регистрирующий электрод, подключенный к усилителю, вводятся в контакт с мембраной изолированной клетки . Другой электрод помещается в ванну, окружающую клетку или ткань, в качестве контрольного заземляющего электрода. Электрическая цепь может быть сформирована между регистрирующим и контрольным электродами, при этом интересующая клетка находится между ними.
Раствор, заполняющий пипетку-патч, может соответствовать ионному составу раствора ванны, как в случае записи, прикрепленной к клетке, или соответствовать цитоплазме , для записи всей клетки. Раствор в растворе ванны может соответствовать физиологическому внеклеточному раствору, цитоплазме, или быть полностью нефизиологическим, в зависимости от проводимого эксперимента. Исследователь также может изменить состав раствора ванны (или, реже, раствора пипетки), добавляя ионы или лекарства для изучения ионных каналов в различных условиях.
В зависимости от того, что исследователь пытается измерить, диаметр используемого наконечника пипетки может варьироваться, но обычно он находится в диапазоне микрометров . [2] Этот небольшой размер используется для того, чтобы охватить область поверхности клеточной мембраны или «участок», который часто содержит только одну или несколько молекул ионного канала. [3] Этот тип электрода отличается от «острого микроэлектрода», используемого для прокалывания клеток при традиционных внутриклеточных записях , тем, что он запечатывается на поверхности клеточной мембраны, а не вставляется через нее.
В некоторых экспериментах кончик микропипетки нагревается в микрокузнице для получения гладкой поверхности, которая помогает сформировать высокоомное уплотнение с клеточной мембраной. Чтобы получить это высокоомное уплотнение, микропипетку прижимают к клеточной мембране и применяют отсасывание. Часть клеточной мембраны всасывается в пипетку, создавая омега -образную область мембраны, которая, если сформирована правильно, создает сопротивление в диапазоне 10–100 гигаом , называемое «гигаомным уплотнением» или «гигауплотнением». [3] Высокое сопротивление этого уплотнения позволяет электронно изолировать токи, измеряемые через мембранный участок с небольшим конкурирующим шумом , а также обеспечивает некоторую механическую стабильность записи. [4]
Многие усилители с патч-клампом не используют настоящую схему фиксации напряжения , а вместо этого являются дифференциальными усилителями , которые используют электрод ванны для установки уровня нулевого тока (заземления). Это позволяет исследователю поддерживать постоянное напряжение, наблюдая за изменениями тока . Чтобы сделать эти записи, пипетка-патч сравнивается с заземляющим электродом. Затем ток вводится в систему для поддержания постоянного, установленного напряжения. Ток, необходимый для фиксации напряжения, противоположен по знаку и равен по величине току через мембрану. [3]
В качестве альтернативы ячейка может быть зафиксирована током в режиме всей клетки, поддерживая постоянный ток и наблюдая за изменениями мембранного напряжения . [5]
Точное разделение тканей с помощью компресс-вибратома или микротома необходимо в дополнение к методам пэтч-кламп. Поставляя тонкие, однородные срезы тканей, эти устройства обеспечивают оптимальную имплантацию электродов. Чтобы подготовить ткани для исследований пэтч-кламп таким образом, чтобы обеспечить точные и надежные записи, исследователи могут выбирать между использованием вибратомов для более мягких тканей и микротомов для более жестких структур. [6] Leica Biosystems , Carl Zeiss AG являются известными производителями этих устройств.
Можно применять несколько вариаций базовой техники в зависимости от того, что исследователь хочет изучить. Техника изнутри наружу и снаружи наружу называется техникой «вырезанной заплатки», потому что заплатка вырезается (удаляется) из основного тела клетки. Техника прикрепленной к клетке и обе техники вырезанной заплатки используются для изучения поведения отдельных ионных каналов в секции мембраны, прикрепленной к электроду.
Целоклеточный патч и перфорированный патч позволяют исследователю изучать электрическое поведение всей клетки, а не токи отдельных каналов. Целоклеточный патч, который обеспечивает низкоомный электрический доступ к внутренней части клетки, в настоящее время в значительной степени заменил методы регистрации микроэлектродов с высоким сопротивлением для регистрации токов через всю клеточную мембрану.
Для этого метода пипетка запечатывается на клеточной мембране, чтобы получить гигасил (запечатывание с электрическим сопротивлением порядка гигаома), при этом гарантируя, что клеточная мембрана останется неповрежденной. Это позволяет регистрировать токи через один или несколько ионных каналов, содержащихся в участке мембраны, захваченном пипеткой. Прикрепляясь только к внешней стороне клеточной мембраны, происходит очень мало нарушений клеточной структуры. [3] Кроме того, не разрушая внутреннюю часть клетки, любые внутриклеточные механизмы, обычно влияющие на канал, по-прежнему смогут функционировать так, как они функционировали бы физиологически. [7] Используя этот метод, также относительно легко получить правильную конфигурацию, и после получения она становится довольно стабильной. [8]
Для лиганд-управляемых ионных каналов или каналов, которые модулируются метаботропными рецепторами , изучаемый нейротрансмиттер или препарат обычно включают в раствор пипетки, где он может взаимодействовать с тем, что раньше было внешней поверхностью мембраны. Результирующая активность канала может быть отнесена к используемому препарату, хотя обычно невозможно затем изменить концентрацию препарата внутри пипетки. Таким образом, метод ограничен одной точкой на кривой доза-реакция на пластырь. Поэтому доза-реакция достигается с использованием нескольких клеток и пластырей. Однако потенциал-управляемые ионные каналы могут быть последовательно зажаты при различных мембранных потенциалах в одном пластыре. Это приводит к активации канала как функции напряжения, и полная кривая IV (ток-напряжение) может быть установлена только в одном пластыре. Другим потенциальным недостатком этого метода является то, что, так же как внутриклеточные пути клетки не нарушаются, они также не могут быть напрямую изменены. [8]
В методе «изнутри-наружу» участок мембраны прикрепляется к пипетке-патчу, отсоединяется от остальной части клетки, а цитозольная поверхность мембраны подвергается воздействию внешней среды или ванны. [9] Одним из преимуществ этого метода является то, что экспериментатор имеет доступ к внутриклеточной поверхности мембраны через ванну и может изменять химический состав того, чему подвергается внутренняя поверхность мембраны. Это полезно, когда экспериментатор хочет манипулировать средой на внутриклеточной поверхности одиночных ионных каналов. Например, каналы, которые активируются внутриклеточными лигандами, затем можно изучать с помощью диапазона концентраций лигандов.
Для достижения конфигурации «изнутри наружу» пипетка прикрепляется к клеточной мембране, как в режиме прикрепления к клетке, образуя гигасил, а затем оттягивается, чтобы оторвать участок мембраны от остальной части клетки. Отрыв мембранного участка часто приводит к первоначальному образованию везикулы мембраны в кончике пипетки, поскольку концы мембраны участка быстро сливаются после иссечения. Затем внешняя поверхность везикулы должна быть разорвана, чтобы войти в режим «изнутри наружу»; это можно сделать, кратковременно проведя мембрану через интерфейс раствор для ванны/воздух, подвергнув воздействию раствора с низким содержанием Ca 2+ или кратковременно соприкоснувшись с каплей парафина или куском отвержденного силиконового полимера. [10]
Записи целых клеток включают запись токов через несколько каналов одновременно, по большой области клеточной мембраны. Электрод остается на месте на клетке, как и при записях, прикрепленных к клетке, но применяется большее всасывание для разрыва мембранного участка, тем самым обеспечивая доступ изнутри пипетки к внутриклеточному пространству клетки. Это дает возможность вводить и изучать, как лечение (например, лекарства) может влиять на клетки в режиме реального времени. [11] После того, как пипетка прикреплена к клеточной мембране, существует два метода разрыва участка. Первый — это применение большего всасывания. Количество и продолжительность этого всасывания зависят от типа клетки и размера пипетки. Другой метод требует, чтобы через пипетку был отправлен большой импульс тока. Сколько тока подается, и продолжительность импульса также зависят от типа клетки. [8] Для некоторых типов клеток удобно применять оба метода одновременно, чтобы разорвать участок.
Преимущество метода патч-кламп для всей клетки по сравнению с методом острого электрода заключается в том, что большее отверстие на кончике электрода патч-кламп обеспечивает меньшее сопротивление и, таким образом, лучший электрический доступ к внутренней части клетки. [12] [11] Недостатком этого метода является то, что поскольку объем электрода больше объема клетки, растворимое содержимое внутренней части клетки будет медленно заменяться содержимым электрода. Это называется «диализом» электрода содержимого клетки. [8] Через некоторое время любые свойства клетки, которые зависят от растворимого внутриклеточного содержимого, будут изменены. Используемый раствор пипетки обычно приближается к среде с высоким содержанием калия внутри клетки, чтобы свести к минимуму любые изменения, которые это может вызвать. Часто в начале метода целой клетки есть период, когда можно провести измерения до того, как клетка будет диализирована. [8]
Название «снаружи-наружу» подчеркивает как взаимодополняемость этой техники с техникой изнутри-наружу, так и тот факт, что она помещает внешнюю, а не внутриклеточную поверхность клеточной мембраны на внешнюю сторону патча мембраны по отношению к патч-электроду. [7]
Формирование патча снаружи-наружу начинается с конфигурации записи всей клетки. После того, как сформирована конфигурация всей клетки, электрод медленно вынимается из клетки, позволяя мембранному мешочку выступить из клетки. Когда электрод вытягивается достаточно далеко, этот мешочек отделяется от клетки и преобразуется в выпуклую мембрану на конце электрода (как шарик, открытый на кончике электрода), причем изначальная внешняя часть мембраны обращена наружу от электрода. [7] Как показано на изображении справа, это означает, что жидкость внутри пипетки будет имитировать внутриклеточную жидкость, в то время как исследователь может свободно перемещать пипетку и мешочек с его каналами в другую ванну с раствором. Хотя в мешочке мембраны может существовать несколько каналов, в этой конформации также возможны одноканальные записи, если мешочек отделенной мембраны небольшой и содержит только один канал. [13]
Патчирование снаружи-вне дает экспериментатору возможность исследовать свойства ионного канала, когда он изолирован от клетки и последовательно подвергается воздействию различных растворов на внеклеточной поверхности мембраны. Экспериментатор может перфузировать один и тот же патч различными растворами за относительно короткий промежуток времени, и если канал активируется нейротрансмиттером или препаратом с внеклеточной поверхности, то можно получить кривую доза-реакция . [14] Эта способность измерять ток через точно такой же кусок мембраны в различных растворах является явным преимуществом патча снаружи-вне по сравнению с методом прикрепления к клетке. С другой стороны, это сложнее осуществить. Более длительный процесс формирования включает больше шагов, которые могут потерпеть неудачу, и приводит к более низкой частоте используемых патчей.
Эта вариация метода патч-клампа очень похожа на конфигурацию всей клетки. Главное отличие заключается в том, что когда экспериментатор формирует гигаомную пломбу, всасывание не используется для разрыва мембраны пэтча. Вместо этого раствор электрода содержит небольшие количества противогрибкового или антибиотического агента, такого как амфотерицин-B , нистатин или грамицидин , который диффундирует в мембранный патч и образует небольшие поры в мембране, обеспечивая электрический доступ к внутренней части клетки. [15] При сравнении методов цельной клетки и перфорированной пэтча можно представить себе цельноклеточную пэтч как открытую дверь, в которой происходит полный обмен между молекулами в растворе пипетки и цитоплазмой. Перфорированную пэтч можно сравнить с дверью-сеткой, которая допускает обмен только определенными молекулами из раствора пипетки в цитоплазму клетки.
Преимущества метода перфорированной заплатки по сравнению с записями целых клеток включают свойства пор антибиотика, которые позволяют уравновешивать только небольшие одновалентные ионы между пипеткой и цитозолем, но не более крупные молекулы, которые не могут проникать через поры. Это свойство поддерживает эндогенные уровни двухвалентных ионов, таких как Ca 2+ , и сигнальных молекул, таких как цАМФ . Следовательно, можно иметь записи всей клетки, как при защелкивании всей клетки, сохраняя при этом большинство внутриклеточных сигнальных механизмов, как при записях, прикрепленных к клеткам. В результате снижается ток, и стабильные записи перфорированной заплатки могут длиться более одного часа. [15] Недостатки включают более высокое сопротивление доступа по сравнению с записями целых клеток из-за частичной мембраны, занимающей кончик электрода. Это может снизить разрешение тока и увеличить шум записи. Также может потребоваться значительное время, чтобы антибиотик пробил мембрану (около 15 минут для амфотерицина-B и еще больше для грамицидина и нистатина). Мембрана под кончиком электрода ослабляется перфорациями, образованными антибиотиком, и может разорваться. Если заплатка разрывается, запись осуществляется в режиме всей клетки, при этом антибиотик загрязняет внутреннюю часть клетки. [15]
Свободный патч-зажим отличается от других обсуждаемых здесь методов тем, что он использует свободный затвор (низкое электрическое сопротивление), а не плотный гигасил, используемый в обычной технике. Этот метод использовался еще в 1961 году, как описано в статье Стрикхолма об импедансе поверхности мышечной клетки [16] , но не получил должного внимания, пока не был поднят снова и не получил название от Альмерса, Стэнфилда и Штюмера в 1982 году [17] после того, как патч-зажим был признан основным инструментом электрофизиологии.
Чтобы добиться свободного патч-зажима на клеточной мембране, пипетку медленно перемещают по направлению к клетке, пока электрическое сопротивление контакта между клеткой и пипеткой не увеличится до нескольких раз большего сопротивления, чем сопротивление одного электрода. Чем ближе пипетка к мембране, тем больше становится сопротивление кончика пипетки, но если слишком близко образуется уплотнение, и может быть трудно удалить пипетку, не повредив клетку. Для техники свободного патча пипетка не подходит достаточно близко к мембране, чтобы сформировать гигасил или постоянное соединение, а также не проткнуть клеточную мембрану. [18] Клеточная мембрана остается неповрежденной, а отсутствие плотного уплотнения создает небольшой зазор, через который ионы могут выходить за пределы клетки, не попадая в пипетку.
Значительным преимуществом неплотного уплотнения является то, что используемая пипетка может быть многократно удалена из мембраны после записи, и мембрана останется неповрежденной. Это позволяет проводить повторные измерения в различных местах на одной и той же клетке, не нарушая целостности мембраны. Эта гибкость была особенно полезна исследователям для изучения мышечных клеток, поскольку они сокращаются в реальных физиологических условиях, быстро получая записи и делая это, не прибегая к радикальным мерам, чтобы остановить сокращение мышечных волокон. [17] Основным недостатком является то, что сопротивление между пипеткой и мембраной значительно снижено, что позволяет току протекать через уплотнение и значительно снижает разрешение малых токов. Однако эту утечку можно частично скорректировать, что дает возможность сравнивать и сопоставлять записи, сделанные с разных участков на интересующей клетке. Учитывая это, было подсчитано, что метод неплотного уплотнения может разрешать токи менее 1 мА/см2 . [ 18]
Комбинация клеточной визуализации, секвенирования РНК и патч-клампа, этот метод используется для полной характеристики нейронов в различных модальностях. [19] Поскольку нервные ткани являются одной из самых транскриптомически разнообразных популяций клеток , классификация нейронов по типам клеток для понимания цепей, которые они формируют, является серьезной проблемой для нейробиологов. Объединение классических методов классификации с секвенированием РНК отдельных клеток post hoc оказалось сложным и медленным. Объединяя несколько модальностей данных, таких как электрофизиология , секвенирование и микроскопия , Patch-seq позволяет характеризовать нейроны несколькими способами одновременно. В настоящее время он страдает от низкой пропускной способности по сравнению с другими методами секвенирования, в основном из-за ручного труда, необходимого для достижения успешной записи патч-клампа на нейроне. В настоящее время ведутся исследования по автоматизации технологии патч-клампа, которая также улучшит пропускную способность патч-секвенирования. [20]
Автоматизированные системы патч-клампа были разработаны для сбора больших объемов данных недорого за более короткий период времени. Такие системы обычно включают одноразовое микрофлюидное устройство, либо литой под давлением , либо литой чип из полидиметилсилоксана (PDMS), для захвата клетки или клеток, и интегрированный электрод.
В одной из форм такой автоматизированной системы используется перепад давления, чтобы заставить изучаемые клетки втягиваться в отверстие пипетки до тех пор, пока они не сформируют гигасейл. Затем, при кратковременном воздействии атмосферы на кончик пипетки, часть мембраны, выступающая из пипетки, лопается, и теперь мембрана находится в конформации «изнутри наружу» на кончике пипетки. В полностью автоматизированной системе пипетка и мембранный участок могут затем быстро перемещаться через ряд различных тестовых растворов, что позволяет наносить различные тестовые соединения на внутриклеточную сторону мембраны во время записи. [20]
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )