Серин/треонин-протеинкиназа ATR , также известная как атаксия-телеангиэктазия и белок, связанный с Rad3 ( ATR ) или белок, связанный с FRAP 1 ( FRP1 ), представляет собой фермент , который у людей кодируется геном ATR . [5] [6] Это большая киназа с молекулярной массой около 301,66 кДа. [7] ATR принадлежит к семейству белков киназ, связанных с фосфатидилинозитол-3-киназой . ATR активируется в ответ на разрывы одной нити и работает с ATM для обеспечения целостности генома.
ATR — это серин / треонин -специфическая протеинкиназа , которая участвует в обнаружении повреждений ДНК и активации контрольной точки повреждения ДНК , что приводит к остановке клеточного цикла у эукариот. [8] ATR активируется в ответ на постоянную одноцепочечную ДНК, которая является обычным промежуточным продуктом, образующимся при обнаружении и восстановлении повреждений ДНК . Одноцепочечная ДНК встречается в остановленных репликационных вилках и в качестве промежуточного продукта в путях восстановления ДНК, таких как репарация эксцизии нуклеотидов и репарация гомологичной рекомбинации . ATR активируется во время более постоянных проблем с повреждением ДНК; внутри клеток большинство повреждений ДНК быстро и надежно восстанавливается с помощью других механизмов. ATR работает с партнерским белком, называемым ATRIP, для распознавания одноцепочечной ДНК, покрытой RPA . [9] RPA специфически связывается с ATRIP, который затем рекрутирует ATR через домен активации ATR (AAD) на своей поверхности. Эта ассоциация ATR с RPA является тем, как ATR специфически связывается и работает на одноцепочечной ДНК — это было доказано в ходе экспериментов с клетками, которые имели мутировавшие пути нуклеотидной эксцизии. В этих клетках ATR не мог активироваться после повреждения УФ-излучением, что показывает необходимость одноцепочечной ДНК для активности ATR. [10] Кислотная альфа-спираль ATRIP связывается с основной щелью в большой субъединице RPA, создавая сайт для эффективного связывания ATR. [11] Существует много других белков, которые привлекаются к сайту одноцепочечной ДНК, необходимому для активации ATR. В то время как RPA привлекает ATRIP, комплекс RAD9-RAD1-HUS1 (9-1-1) загружается на ДНК, смежную с одноцепочечной ДНК; хотя ATRIP и комплекс 9-1-1 привлекаются независимо к месту повреждения ДНК, они активно взаимодействуют посредством массивного фосфорилирования после колокализации. [10] Комплекс 9-1-1, кольцевая молекула, связанная с PCNA, позволяет накапливать ATR специфическим для повреждения образом. [11] Для эффективной ассоциации комплекса 9-1-1 с ДНК также необходим RAD17-RFC. [10] Этот комплекс также вносит топоизомеразо-связывающий белок 1 ( TOPBP1 ), который связывает ATR через высококонсервативный AAD. Связывание TOPBP1 зависит от фосфорилирования остатка Ser387 субъединицы RAD9 комплекса 9-1-1. [11]Вероятно, это одна из основных функций комплекса 9-1-1 в этом ответе на повреждение ДНК. Другой важный белок, связывающий TR, был идентифицирован Хааром и др. в 2016 году: антиген 1, ассоциированный с опухолью Юинга (ETAA1). Этот белок работает параллельно с TOPBP1, активируя ATR через консервативный AAD. Предполагается, что этот путь, который работает независимо от пути TOPBP1, используется для разделения труда и, возможно, реагирования на дифференциальные потребности внутри клетки. [12] Предполагается, что один путь может быть наиболее активным, когда ATR выполняет обычную поддержку реплицирующихся клеток, а другой может быть активным, когда клетка находится в состоянии более экстремального репликативного стресса. [12]
Не только одноцепочечная ДНК активирует ATR, хотя существование одноцепочечной ДНК, связанной с RPA, важно. Вместо этого активация ATR в значительной степени зависит от существования всех ранее описанных белков, которые локализуются вокруг места повреждения ДНК. Эксперимент, в котором RAD9, ATRIP и TOPBP1 были сверхэкспрессированы, доказал, что этих белков по отдельности было достаточно для активации ATR в отсутствие одноцепочечной ДНК, что показывает их важность в запуске этого пути. [11]
После активации ATR он фосфорилирует Chk1 , инициируя каскад передачи сигнала , который завершается остановкой клеточного цикла . Он активирует Chk1 через промежуточный продукт класпина, который связывает два белка вместе. [11] Этот промежуточный продукт класпина должен быть фосфорилирован в двух местах, чтобы выполнить эту работу, что может быть выполнено ATR, но, скорее всего, находится под контролем какой-то другой киназы. [11] Этот ответ, опосредованный Chk1, необходим для регуляции репликации внутри клетки; через путь Chk1-CDC25, который влияет на уровни CDC2, этот ответ, как полагают, снижает скорость синтеза ДНК в клетке и подавляет срабатывание ориджина во время репликации. [11] В дополнение к своей роли в активации контрольной точки повреждения ДНК, ATR, как полагают, функционирует в ненарушенной репликации ДНК. [13] Ответ зависит от того, сколько одноцепочечной ДНК накапливается в остановившихся репликационных вилках. ATR активируется во время каждой S-фазы, даже в нормально циклирующихся клетках, поскольку он работает над мониторингом репликационных вилок для восстановления и остановки клеточного цикла при необходимости. Это означает, что ATR активируется на нормальных фоновых уровнях во всех здоровых клетках. В геноме есть много точек, которые подвержены остановке во время репликации из-за сложных последовательностей ДНК или эндогенного повреждения, которое происходит во время репликации. В этих случаях ATR работает над стабилизацией вилок, чтобы репликация ДНК могла происходить так, как и должно. [11]
ATR связан со второй киназой, активирующей контрольную точку, ATM , которая активируется двухцепочечными разрывами ДНК или нарушением хроматина. [14] ATR также, как было показано, работает с двухцепочечными разрывами (DSB), действуя более медленно, чтобы устранить общие резекции концов, которые происходят в DSB, и, таким образом, оставляя длинные цепи одноцепочечной ДНК (которые затем идут на сигнал ATR). [ 11] В этом случае ATM рекрутирует ATR, и они работают в партнерстве, чтобы отреагировать на это повреждение ДНК. [11] Они отвечают за «медленную» реакцию повреждения ДНК, которая в конечном итоге может вызвать p53 в здоровых клетках и, таким образом, привести к остановке клеточного цикла или апоптозу. [10]
Мутации в ATR встречаются очень редко. Полное отключение ATR ответственно за раннюю смерть эмбрионов мышей, показывая, что это белок с важными жизненными функциями. Предполагается, что это может быть связано с его вероятной активностью в стабилизации фрагментов Оказаки на отстающих цепях ДНК во время репликации или из-за его работы по стабилизации остановившихся репликационных вилок, которые происходят естественным образом. В этой ситуации ATR необходим для предотвращения коллапса вилок, что может привести к обширному двухцепочечному разрыву по всему геному. Накопление этих двухцепочечных разрывов может привести к гибели клетки. [11]
Мутации в ATR ответственны за синдром Секкеля , редкое заболевание человека, которое имеет некоторые общие характеристики с атаксией-телеангиэктазией , которая является результатом мутации ATM . [15]
ATR также связан с семейной кожной телеангиэктазией и раковым синдромом. [16]
Ингибиторы ATR/ChK1 могут усиливать действие агентов, сшивающих ДНК, таких как цисплатин и аналоги нуклеозидов, такие как гемцитабин . [17] Первые клинические испытания с использованием ингибиторов ATR были инициированы компанией AstraZeneca, предпочтительно у пациентов с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), пролимфоцитарным лейкозом (ПЛЛ) или В-клеточной лимфомой с мутацией ATM, а также компанией Vertex Pharmaceuticals у пациентов с запущенными солидными опухолями. [18] ATR предоставил захватывающую точку для потенциального нацеливания на эти солидные опухоли, поскольку многие опухоли функционируют посредством активации ответа на повреждение ДНК. Эти опухолевые клетки полагаются на пути, подобные ATR, для снижения репликативного стресса в раковых клетках, которые неконтролируемо делятся, и, таким образом, эти же клетки могут быть очень восприимчивы к нокауту ATR. [19] У мышей ATR-Seckel после воздействия канцерогенных агентов путь ответа на повреждение ДНК фактически обеспечивал устойчивость к развитию опухолей (6). После многочисленных скринингов для выявления специфических ингибиторов ATR в настоящее время четыре из них прошли клинические испытания фазы I или фазы II с 2013 года; к ним относятся AZD6738, M6620 (VX-970), BAY1895344 [20] (Элимусертиб). [21] и M4344 (VX-803) (10). Эти ингибиторы ATR помогают клетке пройти через независимый от p53 апоптоз, а также форсируют митотический вход, что приводит к митотической катастрофе. [19]
В одном исследовании Флинна и др. было обнаружено, что ингибиторы ATR работают особенно хорошо в раковых клетках, которые полагаются на альтернативный путь удлинения теломер (ALT). Это связано с присутствием RPA при установлении ALT, который привлекает ATR для регулирования гомологичной рекомбинации. Этот путь ALT был чрезвычайно хрупким при ингибировании ATR, и, таким образом, использование этих ингибиторов для нацеливания на этот путь, который сохраняет раковые клетки бессмертными, может обеспечить высокую специфичность к упрямым раковым клеткам. [22]
Примеры включают в себя
Дефицит экспрессии ATR у взрослых мышей приводит к появлению возрастных изменений, таких как поседение волос, выпадение волос, кифоз (округлая верхняя часть спины), остеопороз и инволюция тимуса. [23] Кроме того, с возрастом наблюдается резкое снижение тканеспецифических стволовых и прогениторных клеток, а также истощение обновления тканей и гомеостатической способности. [23] Также наблюдалась ранняя и постоянная потеря сперматогенеза. Однако не было значительного увеличения риска опухолей.
У людей гипоморфные мутации (частичная потеря функции гена) в гене ATR связаны с синдромом Секкеля, аутосомно-рецессивным заболеванием, характеризующимся пропорциональной карликовостью , задержкой развития, выраженной микроцефалией , неправильным прикусом зубов и грудным кифозом . [24] У пациентов с синдромом Секкеля также часто отмечался старческий или прогероидный внешний вид. [23] В течение многих лет мутация, обнаруженная в двух семьях, которым впервые поставили диагноз синдром Секкеля, была единственной мутацией, вызывающей это заболевание.
В 2012 году Оги и его коллеги обнаружили несколько новых мутаций, которые также вызывали заболевание. Одна из форм заболевания, которая включала мутацию в генах, кодирующих белок-партнер ATRIP, считается более тяжелой, чем форма, которая была обнаружена впервые. [25] Эта мутация привела к тяжелой микроцефалии и задержке роста, микротии, микрогнатии, скученности зубов и проблемам со скелетом (что подтверждается уникальным ростом надколенника). Секвенирование показало, что эта мутация ATRIP произошла, скорее всего, из-за неправильного сплайсинга, что привело к фрагментам гена без экзона 2. Клетки также имели бессмысленную мутацию в экзоне 12 гена ATR, что привело к укорочению белка ATR. Обе эти мутации привели к более низким уровням ATR и ATRIP, чем в клетках дикого типа, что привело к недостаточной реакции на повреждение ДНК и тяжелой форме синдрома Секкеля, упомянутой выше. [25]
Исследователи также обнаружили, что гетерозиготные мутации в ATR были ответственны за возникновение синдрома Секкеля. Две новые мутации в одной копии гена ATR вызвали недостаточную экспрессию как ATR, так и ATRIP. [25]
Соматические клетки мышей с дефицитом ATR имеют пониженную частоту гомологичной рекомбинации и повышенный уровень хромосомных повреждений. [26] Это открытие подразумевает, что ATR необходим для гомологичной рекомбинационной репарации эндогенных повреждений ДНК.
Mei-41 является ортологом ATR у Drosophila . [27] Во время митоза у Drosophila повреждения ДНК, вызванные экзогенными агентами, восстанавливаются с помощью процесса гомологичной рекомбинации , который зависит от mei-41(ATR). Мутанты, дефектные по mei-41(ATR), обладают повышенной чувствительностью к уничтожению под воздействием повреждающих ДНК агентов УФ , [28] и метилметансульфоната . [28] [29] Дефицит mei-41(ATR) также вызывает снижение спонтанной аллельной рекомбинации (кроссинговера) во время мейоза [28], что позволяет предположить, что mei-41(ATR) дикого типа используется в рекомбинационной репарации спонтанных повреждений ДНК во время мейоза .
Было показано, что атаксия-телеангиэктазия и белок, связанный с Rad3, взаимодействуют с: