stringtranslate.com

ДНК-лигаза

ДНК-лигаза — это тип фермента, который облегчает соединение цепей ДНК , катализируя образование фосфодиэфирной связи . Он играет роль в восстановлении одноцепочечных разрывов дуплексной ДНК в живых организмах, но некоторые формы (например, ДНК-лигаза IV ) могут специфически восстанавливать двухцепочечные разрывы (т.е. разрыв обеих комплементарных цепей ДНК). Однонитевые разрывы восстанавливаются с помощью ДНК-лигазы, используя комплементарную цепь двойной спирали в качестве матрицы [1] , при этом ДНК-лигаза создает конечную фосфодиэфирную связь для полного восстановления ДНК.

ДНК-лигаза используется как для репарации ДНК , так и для репликации ДНК (см. Лигазы млекопитающих ). Кроме того, ДНК-лигаза широко используется в лабораториях молекулярной биологии для экспериментов по рекомбинантной ДНК (см. «Исследовательские применения »). Очищенная ДНК-лигаза используется при клонировании генов для соединения молекул ДНК с образованием рекомбинантной ДНК .

Ферментативный механизм

На изображении показано, как лигаза (желтый овал) катализирует две цепи фрагмента ДНК. Лигаза соединяет два фрагмента ДНК, образуя более длинную цепь ДНК, «склеивая» их вместе.

Механизм ДНК-лигазы заключается в образовании двух ковалентных фосфодиэфирных связей между 3'-гидроксильными концами одного нуклеотида («акцептор») и 5'-фосфатным концом другого («донор»). На каждую образовавшуюся фосфодиэфирную связь расходуются две молекулы АТФ. [ нужна цитация ] AMP необходим для лигазной реакции, которая протекает в четыре этапа:

  1. Реорганизация места активности, например, разрывы в сегментах ДНК или фрагментах Оказаки и т. д.
  2. Аденилирование (присоединение АМФ) остатка лизина в активном центре фермента, высвобождается пирофосфат ;
  3. Перенос АМФ на 5'-фосфат так называемого донора, образование пирофосфатной связи;
  4. Образование фосфодиэфирной связи между 5'-фосфатом донора и 3'-гидроксилом акцептора. [2]
Наглядный пример того, как работает лигаза (с липкими концами )

Лигаза также будет работать с тупыми концами , хотя требуются более высокие концентрации фермента и другие условия реакции.

Типы

кишечная палочка

ДНК -лигаза E. coli кодируется геном lig . ДНК-лигаза в E. coli , как и у большинства прокариот, использует энергию, полученную при расщеплении никотинамидадениндинуклеотида (НАД), для создания фосфодиэфирной связи. [3] Он не лигирует ДНК с тупыми концами, за исключением условий молекулярной скученности полиэтиленгликолем , и не может эффективно соединять РНК с ДНК. [ нужна цитата ]

Активность ДНК-лигазы E. coli может быть усилена ДНК-полимеразой в правильных концентрациях. Усиление работает только тогда, когда концентрации ДНК-полимеразы 1 намного ниже, чем концентрации фрагментов ДНК, подлежащих лигированию. Повышение концентрации ДНК-полимераз Pol I оказывает неблагоприятное воздействие на ДНК-лигазу E. coli [4].

Т4

ДНК-лигаза бактериофага Т4 ( бактериофага , инфицирующего бактерии Escherichia coli ). Лигаза Т4 наиболее часто используется в лабораторных исследованиях. [5] Он может лигировать как слипшиеся, так и тупые концы ДНК, олигонуклеотиды, а также гибриды РНК и РНК-ДНК, но не одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Он также может лигировать ДНК с тупыми концами с гораздо большей эффективностью, чем ДНК-лигаза E. coli . В отличие от ДНК-лигазы E. coli , ДНК-лигаза Т4 не может использовать НАД и абсолютно необходима АТФ в качестве кофактора. Были проведены некоторые инженерные разработки для улучшения активности ДНК-лигазы Т4 in vitro ; один успешный подход, например, протестировал ДНК-лигазу Т4, слитую с несколькими альтернативными ДНК-связывающими белками, и обнаружил, что конструкции с p50 или NF-kB в качестве партнеров слияния были более чем на 160% более активны при лигировании тупых концов для целей клонирования, чем конструкции дикого типа. ДНК-лигаза Т4. [6] В типичной реакции вставки фрагмента в плазмидный вектор используется от 0,01 (липкие концы) до 1 (тупые концы) единицы лигазы. Оптимальная температура инкубации ДНК-лигазы Т4 составляет 16 °С. [ нужна цитата ]

Мутанты лигазы бактериофага Т4 обладают повышенной чувствительностью как к УФ- облучению [7] [8], так и к алкилирующему агенту метилметансульфонату [9] , что указывает на то, что ДНК-лигаза используется для восстановления повреждений ДНК , вызванных этими агентами.

млекопитающее

У млекопитающих существует четыре конкретных типа лигазы.

  1. ДНК-лигаза I : лигирует возникающую ДНК отстающей цепи после того, как рибонуклеаза H удалила праймер РНК из фрагментов Оказаки .
  2. ДНК-лигаза III : образует комплексы с белком репарации ДНК XRCC1 , помогая запечатывать ДНК в процессе эксцизионной репарации нуклеотидов и рекомбинантных фрагментов. Из всех известных ДНК-лигаз млекопитающих только Lig III присутствует в митохондриях.
  3. ДНК-лигаза IV : комплексы с XRCC4 . Он катализирует заключительный этап пути восстановления негомологичного конца двухцепочечного разрыва ДНК. Он также необходим для рекомбинации V(D)J — процесса, который генерирует разнообразие локусов иммуноглобулинов и рецепторов Т-клеток во время развития иммунной системы .

ДНК-лигаза эукариот и некоторых микробов использует аденозинтрифосфат (АТФ), а не НАД. [3]

Термостабильный

Полученный из термофильной бактерии, фермент стабилен и активен при гораздо более высоких температурах, чем обычные ДНК-лигазы. Период его полураспада составляет 48 часов при 65°С и более 1 часа при 95°С. Было показано, что амплигаза ДНК-лигаза активна в течение как минимум 500 термических циклов (94 °C/80 °C) или 16 часов езды на велосипеде. 10  Эта исключительная термостабильность обеспечивает чрезвычайно высокую строгость гибридизации и специфичность лигирования. [11]

Измерение активности

Для измерения активности ДНК-лигазы используются как минимум три различных единицы: [12]

Исследовательские приложения

ДНК-лигазы стали незаменимыми инструментами в современных молекулярно-биологических исследованиях для создания рекомбинантных последовательностей ДНК. Например, ДНК-лигазы используются с ферментами рестрикции для вставки фрагментов ДНК, часто генов , в плазмиды .

Контроль оптимальной температуры является жизненно важным аспектом проведения эффективных экспериментов по рекомбинации, включающих лигирование фрагментов со слипшимися концами. В большинстве экспериментов используется ДНК-лигаза Т4 (выделенная из бактериофага Т4 ), которая наиболее активна при 37 °C. [13] Однако для оптимальной эффективности лигирования фрагментов со слипшимися концами («липкие концы») оптимальная температура фермента должна быть сбалансирована с температурой плавления T m лигируемых липких концов, [14] гомологичным спариванием липкие концы не будут стабильными, поскольку высокая температура разрушает водородные связи . Реакция лигирования наиболее эффективна, когда липкие концы уже стабильно отожжены, и поэтому разрушение отжигаемых концов может привести к низкой эффективности лигирования. Чем короче свес , тем ниже T m .

Поскольку фрагменты ДНК с тупыми концами не имеют сцепленных концов, которые можно было бы отжигать, температура плавления не является фактором, который следует учитывать в нормальном температурном диапазоне реакции лигирования. Ограничивающим фактором при лигировании тупых концов является не активность лигазы, а количество происходящих выравниваний между концами фрагментов ДНК. Таким образом, наиболее эффективной температурой лигирования ДНК с тупыми концами будет температура, при которой может произойти наибольшее количество выравниваний. Большинство перевязок с тупыми концами проводят при температуре 14–25 °C в течение ночи. Отсутствие стабильно отожженных концов также означает, что эффективность лигирования снижается, что требует использования более высокой концентрации лигазы. [14]

Новое применение ДНК-лигазы можно увидеть в области нанохимии, особенно в ДНК-оригами. Принципы самосборки, основанные на ДНК, оказались полезными для организации наноразмерных объектов, таких как биомолекулы, наномашины, наноэлектронные и фотонные компоненты. Сборка такой наноструктуры требует создания сложной сети молекул ДНК. Хотя самосборка ДНК возможна без какой-либо внешней помощи с использованием различных субстратов, таких как кататоническая поверхность алюминиевой фольги, ДНК-лигаза может оказать ферментативную помощь, необходимую для создания решетчатой ​​структуры ДНК из остатков ДНК. [15]

История

Первая ДНК-лигаза была очищена и охарактеризована в 1967 году лабораториями Геллерта, Лемана, Ричардсона и Гурвица. [16] Впервые он был очищен и охарактеризован Вайсом и Ричардсоном с использованием шестиэтапного процесса хроматографического фракционирования, начинающегося с удаления клеточного мусора и добавления стрептомицина, за которым следовали несколько промывок колонки с диэтиламиноэтил (DEAE)-целлюлозой и окончательное фракционирование фосфоцеллюлозы. Конечный экстракт содержал 10% активности, первоначально зафиксированной в  среде E. coli  ; В ходе процесса было обнаружено, что АТФ и Mg++ необходимы для оптимизации реакции. Обычные коммерчески доступные ДНК-лигазы были первоначально обнаружены в бактериофаге Т4 , E.coli и других бактериях . [17]

расстройства

Генетические дефициты ДНК-лигаз человека связаны с клиническими синдромами, характеризующимися иммунодефицитом, чувствительностью к радиации и аномалиями развития.  [16] Синдром LIG4 (синдром лигазы IV) представляет собой редкое заболевание, связанное с мутациями ДНК-лигазы 4 и препятствующее разрыву дцДНК. ремонтные механизмы. Синдром лигазы IV вызывает у людей иммунодефицит и обычно связан с микроцефалией и гипоплазией костного мозга. [18] Список распространенных заболеваний, вызванных отсутствием или нарушением работы ДНК-лигазы, выглядит следующим образом.

Пигментная ксеродерма

Пигментная ксеродерма, широко известная как XP, представляет собой наследственное заболевание, характеризующееся крайней чувствительностью к ультрафиолетовым (УФ) лучам солнечного света. Это заболевание чаще всего поражает глаза и участки кожи, подвергающиеся воздействию солнца. У некоторых пострадавших также наблюдаются проблемы с нервной системой. [19]

Атаксия-телеангиэктазия

Мутации в гене ATM вызывают  атаксию-телеангиэктазию . Ген ATM дает инструкции по созданию белка, который помогает контролировать деление клеток и участвует в восстановлении ДНК. Этот белок играет важную роль в нормальном развитии и деятельности ряда систем организма, включая нервную и иммунную системы. Белок АТМ помогает клеткам распознавать поврежденные или сломанные цепи ДНК и координирует восстановление ДНК, активируя ферменты, которые восстанавливают сломанные цепи. Эффективное восстановление поврежденных цепей ДНК помогает поддерживать стабильность генетической информации клетки. У больных детей обычно возникают трудности при ходьбе, проблемы с равновесием и координацией рук, непроизвольные подергивания (хорея), мышечные подергивания (миоклонус) и нарушения функции нервов (нейропатия). Проблемы с передвижением обычно приводят к тому, что в подростковом возрасте людям требуется помощь инвалидной коляски. Люди с этим расстройством также имеют невнятную речь и проблемы с перемещением глаз, чтобы посмотреть из стороны в сторону (глазодвигательная апраксия). [20]

Анемия Фанкони

Анемия Фанкони (АФ) — редкое наследственное заболевание крови, приводящее к недостаточности костного мозга. FA не позволяет костному мозгу производить достаточно новых клеток крови, чтобы организм мог нормально работать. FA также может привести к тому, что костный мозг выработает много дефектных клеток крови. Это может привести к серьезным проблемам со здоровьем, например, лейкемии . [21]

Синдром Блума

Синдром Блума приводит к тому, что кожа становится чувствительной к воздействию солнечных лучей, и обычно к появлению пятен покрасневшей кожи в форме бабочки на носу и щеках. Кожная сыпь может также появиться на других участках, которые обычно подвергаются воздействию солнца, например, на тыльной стороне кистей и предплечьях. В сыпи часто появляются небольшие скопления расширенных кровеносных сосудов (телеангиэктазии); телеангиэктазии также могут возникать в глазах. Другие особенности кожи включают участки кожи, которые светлее или темнее окружающих участков (гипопигментация или гиперпигментация соответственно). Эти пятна появляются на участках кожи, не подвергающихся воздействию солнца, и их развитие не связано с высыпаниями.

Как мишень для наркотиков

В недавних исследованиях ДНК-лигаза I человека использовалась в компьютерной разработке лекарств для идентификации ингибиторов ДНК-лигазы в качестве возможных терапевтических средств для лечения рака. [22] Поскольку чрезмерный рост клеток является признаком развития рака, таргетная химиотерапия, которая нарушает функционирование ДНК-лигазы, может препятствовать адъювантным формам рака. Кроме того, было показано, что ДНК-лигазы можно разделить на две категории, а именно АТФ- и НАД + -зависимые. Предыдущие исследования показали, что, хотя НАД + -зависимые ДНК-лигазы были обнаружены в спорадических клеточных или вирусных нишах за пределами бактериальной области жизни, не существует ни одного случая, когда НАД + -зависимая лигаза присутствовала бы в эукариотическом организме. Наличие исключительно у неэукариотических организмов, уникальная субстратная специфичность и отличительная доменная структура НАД+-зависимых по сравнению с АТФ-зависимыми ДНК-лигаз человека в совокупности делают НАД + -зависимые лигазы идеальными мишенями для разработки новых антибактериальных препаратов. [16]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Паскаль Дж.М., О'Брайен П.Дж., Томкинсон А.Е., Элленбергер Т. (ноябрь 2004 г.). «ДНК-лигаза человека I полностью окружает и частично раскручивает разорванную ДНК». Природа . 432 (7016): 473–8. Бибкод : 2004Natur.432..473P. дои : 10.1038/nature03082. PMID  15565146. S2CID  3105417.
  2. ^ Lehman IR (ноябрь 1974 г.). «ДНК-лигаза: структура, механизм и функции». Наука . 186 (4166): 790–7. Бибкод : 1974Sci...186..790L. дои : 10.1126/science.186.4166.790. PMID  4377758. S2CID  86549159.
  3. ^ аб Фостер Дж. Б., Слончевски Дж. (2010). Микробиология: развивающаяся наука (второе изд.). Нью-Йорк: WW Norton & Company. ISBN 978-0-393-93447-2.
  4. ^ Ян Ю, LiCata VJ (февраль 2018 г.). «ДНК-полимеразы Pol I стимулируют соединение концов ДНК с помощью ДНК-лигазы Escherichia coli». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 497 (1): 13–18. дои : 10.1016/j.bbrc.2018.01.165 . ПМИД  29409896.
  5. ^ «Лигазы» (PDF) . Руководство по ферментным ресурсам . Корпорация Промега. стр. 8–14.
  6. ^ Уилсон Р.Х., Мортон С.К., Дейдерик Х., Герт М.Л., Пол Х.А., Гербер I, Патель А.Д., Эллингтон А.Д., Хунике-Смит С.П., Патрик В.М. (июль 2013 г.). «Сконструированные ДНК-лигазы с улучшенной активностью in vitro». Белковая инженерия, проектирование и отбор . 26 (7): 471–8. дои : 10.1093/протеин/gzt024 . ПМИД  23754529.
  7. ^ Болди МВ (1968). «Репарация и рекомбинация в фаге Т4. II. Гены, влияющие на чувствительность к ультрафиолетовому излучению». Симпозиумы Колд-Спринг-Харбор по количественной биологии . 33 : 333–8. дои : 10.1101/sqb.1968.033.01.038. ПМИД  4891973.
  8. ^ Болди М.В. (февраль 1970 г.). «Чувствительность к УФ-излучению некоторых чувствительных к температуре мутантов фага Т4 с ранней функцией». Вирусология . 40 (2): 272–87. дои : 10.1016/0042-6822(70)90403-4. ПМИД  4909413.
  9. ^ Болди М.В., Стром Б., Бернштейн Х. (март 1971 г.). «Репарация дезоксирибонуклеиновой кислоты алкилированного бактериофага Т4 по механизму с участием полинуклеотидлигазы». Журнал вирусологии . 7 (3): 407–8. дои : 10.1128/JVI.7.3.407-408.1971. ПМК 356131 . ПМИД  4927528. 
  10. ^ Томкинсон, Алан Э; Саллмир, Аннахита (5 сентября 2013 г.). «Структура и функция ДНК-лигаз, кодируемых геном LIG3 млекопитающих». Джин . 531 (2): 150–157. дои : 10.1016/j.gene.2013.08.061. ПМЦ 3881560 . ПМИД  24013086. 
  11. ^ «Амплигаза - термостабильная ДНК-лигаза». www.epibio.com . Архивировано из оригинала 19 июня 2017 г. Проверено 15 мая 2017 г.
  12. ^ Рассел Д.В., Сэмбрук Дж. (2001). «Глава 1: Плазмиды и их полезность в молекулярном клонировании». Молекулярное клонирование: лабораторное пособие . Том. 1 (3-е изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. стр. 1–159. ISBN 978-0-87969-577-4.
  13. ^ Бэнейкс Ф, Люкотт Г (1993). Введение в методы молекулярного клонирования . Чичестер: Джон Уайли и сыновья. п. 156. ИСБН 978-0-471-18849-0.
  14. ^ ab Tabor S (май 2001 г.). «ДНК-лигазы». Современные протоколы молекулярной биологии . Глава 3: Раздел 3.14. дои : 10.1002/0471142727.mb0314s08. ISBN 978-0-471-14272-0. PMID  18265223. S2CID  23944826.
  15. ^ Бханджадео М.М., Наяк АК, Субудхи У (2017). «Самосборка ДНК с помощью поверхности: безэнзимная стратегия формирования разветвленной решетки ДНК». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 485 (2): 492–498. дои : 10.1016/j.bbrc.2017.02.024. ПМИД  28189681.
  16. ^ abc Шуман С (июнь 2009 г.). «ДНК-лигазы: прогресс и перспективы». Журнал биологической химии . 284 (26): 17365–9. дои : 10.1074/jbc.R900017200 . ПМК 2719376 . ПМИД  19329793. 
  17. ^ Вайс Б., Ричардсон CC (апрель 1967 г.). «Ферментативный разрыв и присоединение дезоксирибонуклеиновой кислоты, I. Восстановление одноцепочечных разрывов ДНК ферментной системой Escherichia coli, инфицированной бактериофагом Т4». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 57 (4): 1021–8. Бибкод : 1967PNAS...57.1021W. дои : 10.1073/pnas.57.4.1021 . ПМК 224649 . ПМИД  5340583. 
  18. ^ Альтманн Т., Дженнери А.Р. (октябрь 2016 г.). «Синдром ДНК-лигазы IV; обзор». Сиротский журнал редких заболеваний . 11 (1): 137. дои : 10.1186/s13023-016-0520-1 . ПМК 5055698 . ПМИД  27717373. 
  19. ^ «Пигментная ксеродерма» . Домашний справочник по генетике . Проверено 15 мая 2017 г.
  20. ^ «Атаксия-телеангиэктазия». Домашний справочник по генетике . Проверено 15 мая 2017 г.
  21. ^ «Что такое анемия Фанкони?». НХЛБИ, НИЗ . Проверено 15 мая 2017 г.
  22. ^ Томкинсон А.Э., Хоуз Т.Р., Уист, штат Невада (июнь 2013 г.). «ДНК-лигазы как терапевтические мишени». Трансляционное исследование рака . 2 (3). ПМЦ 3819426 . ПМИД  24224145. 

Внешние ссылки