Идентификация генов заболеваний — это процесс, с помощью которого ученые идентифицируют мутантные генотипы , ответственные за наследственное генетическое заболевание . Мутации в этих генах могут включать замены отдельных нуклеотидов, добавления/удаления отдельных нуклеотидов, удаление всего гена и другие генетические аномалии.
Знание того, какие гены (когда они нефункциональны) вызывают какие расстройства, упростит диагностику пациентов и предоставит информацию о функциональных характеристиках мутации. Появление современных высокопроизводительных технологий секвенирования в сочетании с информацией, полученной из развивающейся области геномики , приводит к более быстрой идентификации генов болезней, что позволяет ученым определять более сложные мутации.
Методы идентификации генов заболеваний часто следуют одной и той же общей процедуре. Сначала ДНК собирается у нескольких пациентов, которые, как полагают, имеют одно и то же генетическое заболевание. Затем их образцы ДНК анализируются и проверяются для определения вероятных областей, где мутация может потенциально находиться. Эти методы упомянуты ниже. Затем эти вероятные области выстраиваются друг с другом, и перекрывающаяся область должна содержать мутантный ген. Если известна достаточная часть последовательности генома, в этой области ищутся гены-кандидаты . Затем кодирующие области этих генов секвенируются до тех пор, пока не будет обнаружена мутация или не будет обнаружен другой пациент, в этом случае анализ можно повторить, потенциально сужая область интереса.
Различия между большинством процедур идентификации генов заболеваний заключаются во втором этапе (где образцы ДНК анализируются и проверяются для определения областей, в которых может находиться мутация).
Без помощи последовательностей всего генома, исследования до геномики рассматривали отдельные области генома, часто имея лишь минимальные знания о последовательностях генов, которые они изучали. Генетические методы, способные предоставить такого рода информацию, включают анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) и микросателлитный анализ.
Потеря гетерозиготности (LOH) — это метод, который можно использовать только для сравнения двух образцов одного и того же человека. Анализ LOH часто используется при идентификации онкогенов , вызывающих рак , поскольку один образец состоит из (мутантной) опухолевой ДНК, а другой (контрольный) образец состоит из геномной ДНК из нераковых клеток того же человека. RFLP и микросателлитные маркеры предоставляют образцы полиморфизмов ДНК, которые можно интерпретировать как находящиеся в гетерозиготной области или гомозиготной области генома. При условии, что все люди поражены одним и тем же заболеванием, вызванным проявлением делеции одной копии одного и того же гена, все люди будут содержать один регион, где их контрольный образец гетерозиготен, а мутантный образец гомозиготен — этот регион будет содержать ген заболевания. [1] [2]
С появлением современных лабораторных методов, таких как высокопроизводительное секвенирование и программное обеспечение, способное проводить полногеномный анализ, получение последовательностей стало значительно менее затратным и требующим меньше времени, что принесло значительные преимущества науке в виде более эффективных методов идентификации генов заболеваний.
Картирование идентичности по происхождению (IBD) обычно использует массивы однонуклеотидного полиморфизма (SNP) для исследования известных полиморфных участков по всему геному пораженных лиц и их родителей и/или братьев и сестер, как пораженных, так и здоровых. Хотя эти SNP, вероятно, не вызывают заболевание, они дают ценную информацию о составе рассматриваемых геномов. Область генома считается идентичной по происхождению, если смежные SNP имеют одинаковый генотип. При сравнении пораженного лица с его/ее пораженным братом или сестрой регистрируются все идентичные области (например, заштрихованные красным на рисунке выше). Учитывая, что пораженный брат или сестра и незараженный брат не имеют одинакового фенотипа заболевания, их ДНК по определению должна быть разной (за исключением наличия генетического или экологического модификатора ). Таким образом, результаты картирования IBD могут быть дополнительно дополнены путем удаления любых областей, которые идентичны как у пораженных лиц, так и у незараженных братьев и сестер. [3] Затем это повторяется для нескольких семей, в результате чего образуется небольшой перекрывающийся фрагмент, который теоретически содержит ген заболевания.
Картирование гомозиготности/аутозиготности является мощным методом, но оно применимо только при поиске мутации, сегрегирующей в пределах небольшой закрытой популяции. Такая небольшая популяция, возможно, созданная эффектом основателя , будет иметь ограниченный генофонд, и, таким образом, любое наследственное заболевание, вероятно, будет результатом двух копий одной и той же мутации, сегрегирующей в одном и том же гаплотипе . Поскольку затронутые индивидуумы, вероятно, будут гомозиготными в регионах, просмотр SNP в регионе является адекватным маркером регионов гомозиготности и гетерозиготности. Современные массивы SNP используются для исследования генома и выявления больших регионов гомозиготности. Затем гомозиготные блоки в геномах затронутых индивидуумов можно наложить друг на друга, и перекрывающаяся область должна содержать ген заболевания. [4]
Этот анализ часто расширяется путем анализа аутозиготности , расширения гомозиготности, в геномах затронутых лиц. [5] Это может быть достигнуто путем построения кумулятивного показателя LOD рядом с наложенными блоками гомозиготности. Принимая во внимание частоты аллелей популяции для всех SNP с помощью картирования аутозиготности, результаты гомозиготности могут быть подтверждены. [5] Кроме того, если в результате картирования гомозиготности появляются два подозрительных региона, картирование аутозиготности может быть способно различить их (например, если один блок гомозиготности является результатом очень неразнообразной области генома, показатель LOD будет очень низким).
Инструменты для картирования гомозиготности
Исследования нокдауна по всему геному являются примером обратной генетики, которая стала возможной благодаря получению полных геномных последовательностей и появлению геномики и технологий подавления генов, в основном siRNA и картирования делеций . Исследования нокдауна по всему геному включают систематическое выключение или делецию генов или сегментов генома. [7] Обычно это делается в прокариотах или в среде тканевой культуры из-за огромного количества нокдаунов, которые необходимо выполнить. [8] После завершения систематического выключения (и, возможно, подтверждения анализом экспрессии мРНК) можно наблюдать фенотипические результаты нокдауна/нокаута. Параметры наблюдения могут быть выбраны для нацеливания на высокоспецифичный фенотип. [8] Затем полученный набор данных запрашивается на наличие образцов, которые демонстрируют фенотипы, соответствующие рассматриваемому заболеванию, — ген(ы), выключенные/отключенные в указанных образцах, затем могут считаться генами-кандидатами заболевания для рассматриваемого человека.
Секвенирование всего экзома — это метод грубой силы, который включает использование современных технологий секвенирования и инструментов сборки последовательностей ДНК для объединения всех кодирующих частей генома. Затем последовательность сравнивается с эталонным геномом , и отмечаются любые различия. После фильтрации всех известных доброкачественных полиморфизмов, синонимичных изменений и интронных изменений (которые не влияют на сайты сплайсинга) останутся только потенциально патогенные варианты. Этот метод можно комбинировать с другими методами для дальнейшего исключения потенциально патогенных вариантов, если будет идентифицировано более одного. [9]